TAK1siRNA對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞中mmp9和timp1表達(dá)的影響

蘭忠煜，白希壯，韓曉銳

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，沈陽110001）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱性關(guān)節(jié)骨、軟骨破壞為主要特征。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全清楚［1，2］。TAK1 屬于 MAPKKK 家族成員。MAPKs途徑通過MAPK激酶激酶（MAP3K），MAPK激酶（MAP2K，MEK）和MAPK依次被磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)。P38通過靶向抑制炎性因子釋放起作用［3］，JNK又稱c-jun氨基末端激酶是多數(shù)炎性疾病和代謝疾病的連接點(diǎn)［4］，這些通路與RA聯(lián)系非常緊密。關(guān)節(jié)軟骨侵蝕是RA最為顯著的表現(xiàn)，它的細(xì)胞外基質(zhì)是由蛋白多糖類和膠原構(gòu)成（主要是Ⅱ型膠原），這種結(jié)構(gòu)的完整性是機(jī)械力學(xué)形成的關(guān)鍵［5］?；ぜ?xì)胞分泌的聚蛋白多糖酶（Aggrecanase）可降解蛋白多糖，基質(zhì)金屬蛋白酶9（mmp9）可降解Ⅱ型膠原?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（timp1）能抑制絕大多數(shù)的mmp，可與mmp9前體及有活性的mmp9結(jié)合形成1∶1的化學(xué)復(fù)合物，此外還可以與明膠酶原B特異性結(jié)合使其失活。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

11例滑膜組織標(biāo)本來源于2009年11月至2010年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科住院患者。所有患者診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前均經(jīng)倫理學(xué)認(rèn)證。RA患者男4例，女7例，年齡50～64歲，平均56.2歲。

1.2 試劑

TAK1 siRNA及陰性對(duì)照由Thermo公司提供，靶向siRNA單鏈由4條構(gòu)成，分別為GGACAUUGCUUCUACAAAU、GAGUGAAUCUGGACGUU

UA、GGAAAGCGUUUAUUGUAGA、GCAAUGAGU －UGGUGUUUAC。Real-timePCR試劑盒購(gòu)自于TaKaRa公司，Vimentin試劑盒購(gòu)自于ZYMED公司，相關(guān)引物均由金斯瑞公司合成，見表1。

表1 擴(kuò)增TAK1、t i m p1、m m p9和G APD HeD N A基因片段的引物序列Tab.1 Pri m ersequences f oram pl i f i cat i on of cD N A f ragm ent s of TAKI，t i m p1，m m p9andG APD H Primer Sequence of primers Forward Primer 5′ATTCCACAGATACCAATGGCTC 3′TAK1 Reverse Primer 5′TGTAGTAACAATGCGATTTCGG 3′Forward Primer 5′TGACATCCGGTTCGTCTACA 3′timp1 Reverse Primer 5′TGCAGTTTTCCAGCAATGAG 3′Forward Primer 5′TGGGCAAGGGCGTCGTGGTT 3′mmp9 Reverse Primer 5′GGTCGTCGGTGTCGTAGTTGGC 3′GAPDH Forward Primer 5′AGGGCATCTTGGGCTACAC 3′Reverse Primer 5′TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 3′

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代細(xì)胞提取及培養(yǎng)：DMEM和胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。無菌切取滑膜組織，PBS反復(fù)沖洗，去除表面滑液。剪成糊狀，置于1 g/LⅠ型膠原酶37℃消化4 h，再加入0.25%胰酶，37℃消化10 min，棄上清，200目紗網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞擴(kuò)增至一定濃度，常規(guī)消化，傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞鑒定：將培養(yǎng)至3代的滑膜細(xì)胞做免疫組化鑒定，取出貼滿細(xì)胞的蓋玻片，10%甲醛溶液固定30 min。晾干后PBS沖洗3次，加入3%H2O25～10 min，PBS沖洗后，加入正常山羊血清、室溫靜置10～15 min，傾去、勿洗、甩干，加一抗過夜。滴加辣根過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗3×3 min，DAB顯色。顯色完全后復(fù)染、脫水、封片。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滑膜細(xì)胞種植于6孔板中，種板濃度3×105/孔。從6孔板中移除培養(yǎng)基，隨機(jī)將培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞分為陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組。嚴(yán)格按照試劑說明書規(guī)定，每孔加入2 mL配制好的FECT（含特異性siRNA）轉(zhuǎn)染液，培養(yǎng)細(xì)胞37℃、5%CO2孵箱中24 h，用于mRNA分析。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：提取RNA前0.5 h加入IL-1β置于孵箱中反應(yīng)。吸盡6孔板中的轉(zhuǎn)染液，加入1 mL Trizol，室溫靜置5 min。氯仿0.2 mL/mL Trizol，1 000 r/min離心15 min，將水相移入新管。異丙醇沉淀RNA，清洗完畢后加入反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中SYBR Premix Ex.TaqTM2× 12.5 μL、上、下游引物各 0.5 μL，三蒸水 9.5 μL，模板 2 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min 變性，95 ℃ 1 min，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。最后延伸72℃5 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料均數(shù)比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

采用細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后在其邊緣有橢圓形、三角形或梭形成纖維樣細(xì)胞長(zhǎng)出，10 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面85%面積，消化傳至3～5代的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形、形態(tài)均一、排列規(guī)則。用Vimetin單抗標(biāo)記后，經(jīng)免疫組化發(fā)現(xiàn)：這些細(xì)胞均一地表達(dá)Vimetin（>95%）、表明所培養(yǎng)的細(xì)胞是滑膜成纖維細(xì)胞。見圖1。

2.2 TAK1對(duì)timp1及mmp9表達(dá)的影響

從細(xì)胞中提取的總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)分析，其A260/A280值處于1.85～2.0之間。以上述總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄獲得高純度cDNA。以此為模板，熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因片段。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TAK1基因沉默效率大于80%。mmp9組實(shí)驗(yàn)組設(shè)定為1，對(duì)照組mRNA表達(dá)量3.967±0.551，明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。沉默TTAK1前后，mmp9實(shí)驗(yàn)組降低率為74.76%。依上述統(tǒng)計(jì)方法timp1實(shí)驗(yàn)組設(shè)定為1，對(duì)照組mRNA表達(dá)量1.460±0.137，高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組沉默率31.51%（見圖2、3）。設(shè)置空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入特異性TAK1siRNA后下調(diào)mmp9∶timp1比率。

3 討論

RA滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）的活化是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)炎性改變的主要原因。大量的炎性因子和炎性介質(zhì)通過MAPKs途徑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性介質(zhì)及MMPs的表達(dá)［6］。TAK1屬于MAPKKK家族成員。MAPKs途徑通過MAP3K，MAP2K和MAPK依次被磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)。目前大量文獻(xiàn)報(bào)道TAK1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)量明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎和正?；そM織。我們的前期實(shí)驗(yàn)通過對(duì)RA滑膜、骨性關(guān)節(jié)炎滑膜和正?；そM織TAK1表達(dá)的研究也證實(shí)了這點(diǎn)。已經(jīng)明確的FLS中調(diào)控炎癥反應(yīng)的通路大致有3條。MMPs超家族作為RA患者軟骨破壞的主要成員，Hammaker［7］通過用 real-timePCR 實(shí)驗(yàn)在FLS中導(dǎo)入TAK1siRNA后mmp3表達(dá)水平明顯下調(diào)。不過尚未見關(guān)于mmp9的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)為了避免體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分化程度與體內(nèi)有所不同，在行real-time PCR前30min于各組中加入IL-1β作為刺激因素。TIMP為MMP的天然抑制劑，timp1能抑制絕大多數(shù)的mmp，可與mmp9前體及有活性的mmp-1、3、9 形成 1：1 復(fù)合體，抑制其活性。Hegemann等［8］研究發(fā)現(xiàn)：timp1由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞合成并分泌，廣泛存在于組織和體液中，并能被多種細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，在巨噬細(xì)胞分泌的IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子刺激下，并在被血漿激肽釋放酶，纖溶酶或組織蛋白酶G等的作用下，轉(zhuǎn)化為具有活性的mmp3的協(xié)同刺激下，并激活滑膜被覆細(xì)胞分泌的膠原蛋白酶，引發(fā)MMPs家族其他成員活化，進(jìn)而使得滑膜被覆細(xì)胞和滑膜下層細(xì)胞同時(shí)合成timp1。MMPs和TIMP之間的比例關(guān)系決定軟骨的破壞程度。

本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)高效抑制TAK1在RA滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，real-time PCR發(fā)現(xiàn)timp1和mmp9的表達(dá)不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。特別是mmp9的表達(dá)量顯著下調(diào)，這種作用在抑制RA患者軟骨破壞中具有重要意義。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)沉默TAK1后mmp9mRNA降低率為74.76%。timp1sRNA降低率31.51%。兩者之間的比例存在明顯的不匹配關(guān)系。提示靶向抑制TAK1可打破MMP與TIMP之間的平衡關(guān)系，降低RA患者軟骨的破壞。為治療RA所導(dǎo)致的軟骨破壞提供基因靶點(diǎn)。由于軟骨破壞反應(yīng)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)基因，多條途徑，TIMP在滑膜細(xì)胞中的調(diào)控途徑及調(diào)控機(jī)制尚未闡明，仍有待進(jìn)一步研究。

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