人線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞順鉑耐藥性機(jī)制的研究

韓斌，白松，欒嵐，吳斌

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110004；2.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院病理科，沈陽 110024）

前列腺癌是一種依靠雄激素成長的惡性腫瘤。由于它對雄激素的依賴性（androgen dependent），臨床上應(yīng)用雄激素阻斷療法治療初發(fā)前列腺癌都會有很好的療效。然而，隨著腫瘤細(xì)胞的變異與進(jìn)展，很多病例變?yōu)樾奂に胤且蕾囆停╝ndrogen independent），雄激素阻斷療法失去療效。而化學(xué)療法包括紫杉醇，唑來磷酸，順鉑等藥物對雄激素非依賴性前列腺癌的療效卻十分有限，探索雄激素非依賴性前列腺癌的耐藥機(jī)制具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文通過雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞系PC3的研究，探討TFAM的表達(dá)與順鉑耐藥性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC3細(xì)胞，及由PC3細(xì)胞培育成的順鉑高耐受性細(xì)胞PCDP6由日本產(chǎn)業(yè)醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用5%CO2，37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%FBS，10 000 U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素。

1.2.2 siRNA干擾：應(yīng)用TFAM siRNA#1與siRNA#2［1］轉(zhuǎn)染 PC3 細(xì)胞。

1.2.3 Western blot：收集細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白。應(yīng)用SDS-PAGE電泳分離樣品蛋白質(zhì)條帶，并應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法把蛋白樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上。NC膜經(jīng)一抗、二抗孵育，洗膜后發(fā)光實(shí)驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 順鉑對PC3細(xì)胞IC50的測定：將siRNA轉(zhuǎn)染干擾后的細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入含不同濃度順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h。MTT法測IC50。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對比不同IC50，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐順鉑細(xì)胞高表達(dá)TFAM

相比于其母細(xì)胞系PC3，順鉑高耐受細(xì)胞PCDP6高表達(dá)TFAM與survivin（圖1），而作為內(nèi)參的β-actin無變化。

2.2 低表達(dá)TFAM的PC3細(xì)胞對順鉑敏感性增強(qiáng)

當(dāng)用小干擾RNA成功降低PC3細(xì)胞TFAM表達(dá)后（圖1），用不同濃度順鉑作用于細(xì)胞，繪制耐藥曲線，計(jì)算IC50。我們觀察到，TFAM表達(dá)降低后，PC3對順鉑敏感性增強(qiáng)，IC50明顯下降，P<0.05（圖2）。

2.3 TFAM可調(diào)控survivin的表達(dá)

轉(zhuǎn)染特異性 siRNA#1，#2到 PC3細(xì)胞降低TFAM表達(dá)后，Western blot結(jié)果顯示survivin的表達(dá)同樣降低。而作為內(nèi)參的β-actin無明顯變化。

3 討論

TFAM是體細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控線粒體活性的因子蛋白，當(dāng)線粒體DNA受到損傷時(shí)，TFAM可以特異性的結(jié)合存在損傷或變異的線粒體DNA序列上，穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)，阻止由DNA損傷引發(fā)的凋亡［2，3］。研究證實(shí)，TFAM的表達(dá)在PC3細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用，并抑制細(xì)胞的凋亡［1］。但TFAM的表達(dá)與PC3細(xì)胞對化療藥物敏感性間的關(guān)系未見報(bào)道。順鉑是烷化劑類的細(xì)胞毒性藥物，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程，較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。癌細(xì)胞內(nèi)，線粒體DNA由于缺乏核小體等結(jié)構(gòu)的保護(hù)，極易受到順鉑的攻擊而損傷，從而誘導(dǎo)凋亡。而TFAM可特異性的結(jié)合在變異的線粒體DNA表面，起修復(fù)和保護(hù)的作用。這從理論機(jī)制上說明TFAM的表達(dá)可對抗順鉑的細(xì)胞毒性。本研究證實(shí)TFAM的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的耐藥性呈正相關(guān)。耐順鉑的PCDP6高表達(dá)TFAM。而成功降低TFAM表達(dá)后，PC3細(xì)胞對順鉑IC50明顯下降。

最新的研究表明，降低survivin表達(dá)后，胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性增強(qiáng)［3］。survivin是廣泛高表達(dá)在于腫瘤細(xì)胞中的蛋白，它在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的作用，包括與前列腺癌的分期分級正相關(guān)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PCDP6中，survivin表達(dá)升高，survivin在癌細(xì)胞耐受順鉑中發(fā)揮作用。而TFAM的表達(dá)可以促進(jìn)survivin的表達(dá)，當(dāng)用小干擾RNA降低TFAM蛋白表達(dá)后，survivin的表達(dá)同樣降低，TFAM與survivin的相關(guān)性說明TFAM也通過調(diào)控survivin參與對順鉑的耐藥。TFAM通過多種通路參與雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中對順鉑的耐藥機(jī)制，可以作為晚期前列腺癌的治療靶點(diǎn)。

［1］Han B，Izumi H，Yasuniwa Y，et al.Human mitochondrial transcription factor A functions in both nuclei and mitochondria and regulates cancer cell growth［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，29408（1）：45-51.

［2］Kang D，Kim SH，Hamasaki N.Mitochondrial transcription factor A（TFAM）：roles in maintenance of mtDNA and cellular functions［J］.Mitochondrion，2007，7（1-2）：39-44.

［3］Shen X，Zheng JY，Shi H，et al.Survivin knockdown enhance gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice［J］.Am J Med Sci，2012 Jan 18［Epub ahead of print］.

［4］于洪波，韓小兵，梁宜騫，等.OPN及survivin在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（5），1141-1143.