穿山龍總皂苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB p65活性及STAT3表達的影響

高亞賢，梁秀軍，董文娟，肖麗君，宋鴻儒

（承德醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 承德 067000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征，以多對稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性的慢性自身免疫功能障礙性疾病，其病理特征為滑膜細胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。血管新生和血管翳的形成在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起了至關(guān)重要的作用。抑制滑膜新生血管形成，減少血管翳的血液供應(yīng)，可以阻止血管翳的生長和進一步對軟骨、骨的破壞，可能是治療RA的一種重要方法［1，2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)穿山龍總皂苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的新生血管數(shù)量及對血管形成具有特異性的因子——血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達水平具有顯著性的抑制作用，但其作用機制尚不完全清楚［3］。已有研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factors-κB，NF-κB）與血管翳生成、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕密切相關(guān)［4］，通過抑制NF-κB的活性可減少VEGF的產(chǎn)生［5］，另有研究發(fā)現(xiàn)，JAKSTAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要底物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白可以直接調(diào)節(jié)VEGF的表達。因此，本研究通過觀察穿山龍（rhizoma dioscreae nipponicae，RDN）總皂苷對CIA大鼠滑膜組織中NF-κB p65及STAT3蛋白表達的影響，旨在從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面探索穿山龍總皂苷治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（160±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：0189066，許可證號SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥物與試劑

牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex公司，弗氏完全佐劑（CFA）購自 Sigma公司，Nuclear Extract Kit，TransAMTMNF-κB p65活性檢測試劑盒，Recombinant NF-κB p65 protein均購自美國 Active Motif公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司，兔抗STAT3單克隆抗體購自美國Epitomics公司，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RDN由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提取。雷公藤多甙片購自黃石飛云制藥有限公司，薯蕷皂苷元購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，穿山龍水溶性薯蕷皂苷片購自東盛科技股份有限公司西安制藥廠。

1.3 CIA模型的建立

將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原（2 mg/mL）與CFA等體積混合，充分乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑。大鼠用10%的水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，在無菌條件下，于大鼠背部及尾根部多點注射（每只0.2 mL）配制好的Ⅱ型膠原乳劑，7 d后按上述方法、相同劑量加強1次，作為激發(fā)注射。正常對照組按同樣的方法注射等體積的生理鹽水。用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）作為判斷模型是否成功的標準。肢體關(guān)節(jié)腫脹按0～Ⅳ級評分：0，無紅腫；Ⅰ，趾關(guān)節(jié)稍腫；Ⅱ，趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹；Ⅲ，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；Ⅳ，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級評分之和（Ⅰ級為1分，總分為16分）［6］。AI≥4分為造模成功。

1.4 實驗動物分組及給藥

80只Wistar大鼠，隨機選取12只作為正常對照組，其余68只大鼠均建立CIA模型，將造模成功的60只CIA大鼠隨機分為CIA模型組（CIA）、雷公藤組（TP）、穿山龍總皂苷組（RDN）、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組，每組各12只。在初次免疫后16 d起，雷公藤組大鼠給予雷公藤多甙片（12 mg·kg-1·d-1）灌胃，穿山龍總皂苷組大鼠給予穿山龍總皂苷（25 mg·kg-1·d-1）灌胃，薯蕷皂苷元組大鼠給予薯蕷皂苷元（25 mg·kg-1·d-1）灌胃，穿山龍水溶性皂苷片組大鼠給予穿山龍水溶性皂苷片（45 mg·kg-1·d-1）灌胃，正常組和CIA模型組大鼠分別給予等體積溶媒（0.5%CMC）灌胃，各組連續(xù)用藥時間均為35 d。

1.5 取材

每組隨機選擇6只大鼠，用10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉后，仰面固定，經(jīng)腹腔靜脈取血處死，立即分別沿著雙側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)正中縱行剪開皮膚，充分暴露出膝關(guān)節(jié)，沿髕骨上緣約0.3～0.4 cm處向下切割至脛骨，打開膝關(guān)節(jié)腔，用眼科鑷完整取下滑膜組織，標記，迅速置于液氮中保存，用于TransAMTMNF-κB p65活性檢測。剩余6只大鼠按同樣方法迅速取下滑膜組織，置于Bouin液中固定，用于檢測STAT3的免疫組織化學(xué)染色。

1.6 NF-κB p65 活性測定

1.6.1 滑膜細胞核蛋白的提?。簠⒄誑uclear Extract Kit說明書的操作步驟，提取滑膜細胞的核蛋白，采用二辛可酸法（BCA分析法）測定樣本核蛋白的濃度，將樣本蛋白分別溶解成1∶50、1∶100的濃度，用酶聯(lián)儀準確測量，最后計算取平均值作為核蛋白的濃度。將核蛋白分裝置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 TransAMTM檢測 NF-κB p65的 DNA活性：TransAMTMNF-κB p65活性檢測試劑盒內(nèi)含一個96孔板，板上包被有NF-κB同源序列（5′-GGGACTTTC C-3′）的寡核苷酸，細胞核內(nèi)活化的NF-κB可以特異性地結(jié)合到寡核苷酸。參照試劑盒說明書設(shè)立空白對照孔（不加入細胞核提取物）、陽性對照孔、特異性或非特異性競爭對照孔（加入野生型或突變型同源寡核苷酸）、recombinant protein孔及各樣品核蛋白孔。首先向各檢測孔中分別加入30 μL完全連接緩沖液或30 μL含有2 μL特定寡核苷酸（野生型或突變型）的完全連接緩沖液；再加入20 μL含有相同質(zhì)量各樣本核提取物或含有1 μL Jurkat（陽性對照）的完全裂解緩沖液，Recombinant protein孔中依次加入20 μL梯度液，封板，室溫下?lián)u床孵育1 h；然后依次經(jīng) NF-κB p65 抗體（1∶1 000），HRP-標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育，最后每孔加入室溫的顯色劑和終止液，5 min之內(nèi)450 nm波長測量出吸光度值，通過標準曲線，換算成ng值，得到蛋白含量。

1.7 用免疫組織化學(xué)染色（SP法）檢測滑膜組織STAT3的表達

取大鼠滑膜組織固定的標本，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片，脫蠟至水以后操作按試劑盒說明書進行，滴加1∶50的兔抗STAT3單克隆抗體，用PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色劑室溫顯色，蘇木素復(fù)染。免疫組織化學(xué)染色以細胞質(zhì)和/或細胞核中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性細胞。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)，以免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為STAT3蛋白的相對表達水平。每只大鼠選取6張切片，每張切片觀察3個視野，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CIA大鼠治療前后AI評分

大鼠初次免疫后14 d逐漸出現(xiàn)足趾部及踝關(guān)節(jié)皮膚發(fā)紅，輕度腫脹等關(guān)節(jié)炎癥狀。造模成功分組以后分別于 16、23、30、37、44、50 d 檢測各組大鼠AI評分，CIA模型組大鼠AI值與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；穿山龍總皂苷組、雷公藤組、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組可明顯抑制CIA大鼠AI值（P＜0.01）；各治療組之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同時間各組大鼠AI評分（±s，n=12）Tab.1 AIofeach group rat s′ paw s i n di f f erentt i m e poi nt s（±s，n=12）Group 16 d 23 d 30 d 37 d 44 d 50 d Normal control 0 0 0 0 0 0 CIA 3.29±0.201） 8.59±0.601） 7.87±0.521） 6.54±0.361） 5.50±0.211） 4.54±0.301）TP 3.36±0.20 6.69±0.382） 6.42±0.242） 5.45±0.522） 4.03±0.552） 3.54±0.562）RDN 3.30±0.24 6.67±0.512） 6.43±0.232） 5.38±0.422） 4.57±0.322） 3.55±0.242）Diosgenin 3.31±0.16 6.75±0.322） 6.40±0.132） 5.48±0.382） 4.64±0.132） 3.86±0.242）Diosgenin tablets 3.25±0.12 6.68±0.352） 6.24±0.182） 5.77±0.212） 4.67±0.182） 3.58±0.122）1）P ＜ 0.01 vs normal control group；2）P ＜ 0.01 vs CIA model group.

2.2 TransAMTMNF-κB p65 kit檢測CIA大鼠滑膜細胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性

CIA模型組與正常對照組比較，大鼠滑膜細胞核蛋白提取物中NF-κB p65的DNA結(jié)合活性顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與CIA模型組相比，穿山龍總皂苷組、雷公藤組、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組的NF-κB p65 DNA結(jié)合活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各治療組之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.3 關(guān)節(jié)滑膜組織STAT3蛋白的表達情況

STAT3陽性信號主要分布于細胞質(zhì)，少量在細胞核中。STAT3蛋白在CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的表達與正常對照組相比顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與CIA模型組相比，穿山龍總皂苷組、雷公藤組、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組STAT3蛋白的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各治療組之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 2，表 2。

3 討論

表2 各組大鼠滑膜組織S T A T 3蛋白表達情況（±s）T a b.2 E x p r e s s i o n o f S T A T 3 p r o t e i n i n s y n o v i u m o f r a t s i n e a c h g r o u p（±s）G r o u p n S T A T 3（%）N o r m a l c o n t r o l 6 0.4 4 8±0.3 5 4 C I A 6 1 1.6 6 9±2.3 7 4 1）T P 6 2.8 3 6±1.6 2 5 2）R D N 6 3.2 8 1±1.3 7 4 2）D i o s g e n i n 6 3.1 0 5±1.6 4 8 2）D i o s g e n i n t a b l e t s 6 2.8 2 6±1.2 8 2 2）1）P ＜ 0.0 1 v s n o r m a l c o n t r o l g r o u p；2）P ＜ 0.0 1 v s C I A m o d e l g r o u p.

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜增生，血管翳形成及對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆宰陨砻庖咝约膊?，其發(fā)病機制尚不十分清楚。VEGF及其受體在血管新生中起著最關(guān)鍵的作用，調(diào)控著內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)［7］。IL-1、TNF-α均可刺激VEGF的表達，進一步促進血管新生。宋鴻儒等［8］早期研究證實穿山龍水煎劑具有免疫抑制作用。穿山龍總皂苷是從RDN的干燥根中提取的有效成分。本課題組前期大量實驗的研究表明，穿山龍總皂苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用［9］，還可以抑制 CIA 大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子的水平，減少CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜新生血管數(shù)量，顯著性下調(diào)VEGF及其受體Flk-1的表達［3］。本實驗中，穿山龍總皂苷可以顯著抑制CIA大鼠的AI值。這些治療作用所通過的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要進一步研究。

NF-κB是RA滑膜炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的一條重要炎性細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。NF-κB與κB抑制蛋白（inhibitory κB，IκB） 相結(jié)合于靜止期細胞的細胞質(zhì)中，隨著IκB的磷酸化和降解，NF-κB被釋放游離并轉(zhuǎn)移至細胞核并激活靶基因表達。這一經(jīng)典途徑中觸發(fā)激活作用最明顯的是p65亞單位的磷酸化。Benito等［4］采用免疫組織化學(xué)及凝膠電泳遷移率改變分析法（EMSA）對早期RA患者關(guān)節(jié)組織的配對研究顯示，在軟骨與血管翳交界部位（CPJ），NF-κB陽性細胞絕對值顯著高于關(guān)節(jié)內(nèi)其他非CPJ部位，提示NF-κB與血管翳生成、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕密切相關(guān)。在高表達NF-κB的裸鼠胰腺癌移植瘤中封閉NF-κB的表達，將下調(diào)VEGF，IL-8等多種促血管生成因子，推測在基因水平上NF-κB調(diào)節(jié)著VEGF的表達［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)在CIA大鼠滑膜組織中NF-κB與VEGF兩者表達顯著正相關(guān)，提示在RA中兩者作用密切相關(guān)，NF-κB可能參與了VEGF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過正向調(diào)節(jié)VEGF的表達，進而影響滑膜血管翳的形成［11］。本實驗選擇的陽性對照藥物雷公藤是目前治療RA藥物中療效最被肯定的單味中藥。雷公藤內(nèi)酯醇可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活性來減少VEGF的產(chǎn)生［5］。課題組前期實驗中表明穿山龍總皂苷能顯著性下調(diào)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF及其受體Flk-1的表達，本研究應(yīng)用TransAMTMNF-κB p65活性檢測試劑盒可以快速、高敏感性、定量分析核轉(zhuǎn)錄因子的活性，采用ELISA方式進行敏感的特異性檢測，其靈敏度是傳統(tǒng)凝膠電泳遷移率實驗法（EMSA）的10倍，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65的DNA結(jié)合活性顯著增高，穿山龍總皂苷治療組能顯著降低其NF-κB p65活性，其治療效果與雷公藤陽性對照組、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示穿山龍總皂苷可能通過抑制NF-κB p65 DNA結(jié)合活性下調(diào)VEGF的表達，進而減少RA血管新生的，與文獻報道相一致。

JAK-STAT是一條重要的介導(dǎo)細胞因子信號傳導(dǎo)的通路，細胞因子能與靶細胞上相應(yīng)的受體相結(jié)合，通過JAK-STAT通路將信號由細胞膜傳至細胞質(zhì)并最終傳至細胞核，而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)［12］。RA滑膜組織中許多細胞因子的表達顯著升高，在RA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而其大多細胞因子通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，因此推測針對性阻斷JAK-STAT通路將可能達到改善RA病理過程的目的［13］。JAK-STAT通路在CIA大鼠發(fā)病過程中處于激活狀態(tài)，給予CIA大鼠JAKSTAT信號通路特異性阻斷劑AG490后，可以抑制STAT1及STAT3的酪氨酸磷酸化，并呈現(xiàn)劑量依賴性，明顯改善關(guān)節(jié)炎大鼠的臨床過程及預(yù)后［14］。STAT3作為JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的底物在介導(dǎo)RA滑膜細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。STAT3是一種能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的細胞質(zhì)蛋白，既具有信號傳導(dǎo)功能又有轉(zhuǎn)錄活化功能。Funamoto有研究證實STAT3蛋白在VEGF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF啟動子區(qū)上存在著STAT3的結(jié)合位點，STAT3蛋白通過該結(jié)合位點可以直接調(diào)節(jié)VEGF的表達，VEGF是STAT3的直接靶基因。當(dāng)在細胞外信號刺激下，STAT3的酪氨酸基團被磷酸化而激活成p-STAT3并在SH2區(qū)形成同源或異源二聚體，隨后p-STAT3蛋白二聚體迅速轉(zhuǎn)位入核結(jié)合并誘導(dǎo)下游基因如VEGF等的異常高表達［15］。本研究檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中STAT3蛋白的表達情況，結(jié)果表明，CIA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中STAT3蛋白的表達顯著增高，而與模型組相比，穿山龍總皂苷及其他治療組均可以顯著的抑制滑膜組織中STAT3蛋白的表達，其治療效果與雷公藤陽性對照組、薯蕷皂苷元組、穿山龍水溶性皂苷片組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮如文獻報道，穿山龍總皂苷通過對STAT3蛋白的抑制直接降低了VEGF的水平。

綜上所述，穿山龍總皂苷可能是通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中NF-κB p65的DNA結(jié)合活性和JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要底物STAT3蛋白的表達，直接下調(diào)VEGF的水平，從而起到抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管新生的作用。另外，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，各條通路存在各種交互聯(lián)系，相互協(xié)同，相互制約，穿山龍總皂苷對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血管新生的抑制作用，可能還會通過其他的途徑，有待于進一步研究。

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