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    氣相色譜-質(zhì)譜法定性分析麝香保心丸揮發(fā)性入血成分的研究

    2012-09-07 13:39:28郭黎安王淑萍向麗姜鵬張衛(wèi)東柳潤輝第二軍醫(yī)大學(xué)訓(xùn)練部藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室上海200433
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2012年3期
    關(guān)鍵詞:龍腦麝香揮發(fā)性

    郭黎安,王淑萍,向麗,姜鵬,張衛(wèi)東,柳潤輝(第二軍醫(yī)大學(xué),.訓(xùn)練部;.藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室,上海 200433)

    氣相色譜-質(zhì)譜法定性分析麝香保心丸揮發(fā)性入血成分的研究

    郭黎安a,王淑萍b,向麗b,姜鵬b,張衛(wèi)東b,柳潤輝b(第二軍醫(yī)大學(xué),a.訓(xùn)練部;b.藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室,上海 200433)

    目的建立氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)定性分析麝香保心丸揮發(fā)性入血成分的方法。方法健康雄性SD大鼠給予麝香保心丸混懸液灌服(劑量3.4 g/kg體重),于口服30 min后肝門靜脈取血,蛋白沉淀法處理血漿樣品進(jìn)行GC-MS分析。分析條件:Thermo TR-5 ms色譜柱;Xcalibur色譜工作站;載氣為氦氣;載氣流速為1.0 ml/min;進(jìn)樣口溫度為220℃;離子源溫度為250℃;梯度升溫;進(jìn)樣體積為1 μl;分析時間59 min。結(jié)果通過比較麝香保心丸提取液、空白組及給藥組,及與在線NIST05數(shù)據(jù)庫比對,共識別和鑒定10個化學(xué)成分,其中6個為麝香保心丸中原型成分,其余4個為代謝物。結(jié)論本研究建立了一種快速篩選麝香保心丸中揮發(fā)性入血成分的方法,可為其深入研究提供基礎(chǔ)。

    麝香保心丸;血清藥物化學(xué);冠心病;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

    麝香保心丸為國家中藥保護(hù)品種,其經(jīng)麝香、人參、蘇合香、肉桂、蟾酥、牛黃、冰片7種藥物配伍組合而成。臨床上主要用于冠心病,動脈粥樣硬化,心肌缺血及心肌纖維化等的治療,效果顯著?,F(xiàn)代藥理研究表明,麝香保心丸具有一系列藥理活性,其可提高NO的水平[1]、提高內(nèi)皮型NO合酶基因的表達(dá)等作用[2]以及能減輕微小血管的損害,下調(diào)MMP-2mRNA和蛋白表達(dá)[3],改善心肌缺血引起的心肌壞死等[4],盡管對其整體藥效機(jī)制評價較多,但其主要藥理活性成分,即復(fù)方主要藥效物質(zhì)尚未得到充分闡明。

    由于中藥復(fù)方為中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的多味藥材經(jīng)配伍組合后的有機(jī)整體,先前的生物活性導(dǎo)向下的植化系統(tǒng)分離模式不能完全闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì),因?yàn)樗雎粤酥兴帍?fù)方整體作用機(jī)制,而且不能反映中藥復(fù)方中的化學(xué)成分體內(nèi)動態(tài)變化過程。近年來,中藥血清藥物化學(xué)研究已經(jīng)成為快速篩選中藥體內(nèi)活性成分的一種有效手段。該技術(shù)基于“口服中藥經(jīng)胃腸道吸收入血的成分有最大可能成為真正藥效成分”的理論,廣泛應(yīng)用于多個中藥復(fù)方藥效成分的篩選[5~7],成果顯著。

    麝香保心丸含有的植物二次代謝產(chǎn)物主要分為揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分組成。本課題組前期研究已經(jīng)闡明了其主要非揮發(fā)成分[8],但麝香保心丸中揮發(fā)性成分尚未完全探討。因此,本研究基于中藥血清藥物化學(xué)理論,建立氣相色譜-質(zhì)譜法(GCMS)定性分析中藥復(fù)方麝香保心丸揮發(fā)性入血成分,擬為中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)研究提供技術(shù)手段。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器質(zhì)譜儀:Thermo GC DSQⅡ氣相色譜儀;Xcalibur色譜工作站;KS5200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);BP211D型電子天平(德國Sartorius);Anke TGL-16C型離心機(jī);Vortex QL-901型渦旋器。

    1.2 試藥麝香保心丸制劑由上海和黃藥業(yè)有限公司提供(批號080105),麝香酮(批號M0128)、肉桂酸(批號ASB-00003655-025)、肉桂醛(批號YY90307)、龍腦(批號M0297)、異龍腦(批號111512)5種對照品均購自中國藥品生物制品檢定所,苯甲酸芐脂購自上海鼎瑞化工有限公司。戊巴比妥鈉、肝素鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。正己烷、乙醚、丙酮、氯仿均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200 ±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,動物許可證號SCXK(滬)2003-0003,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h (自由飲水)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 麝香保心丸分析及灌胃樣品制備

    2.1.1 麝香保心丸分析樣品制備精密稱定麝香保心丸樣品500 mg,研細(xì),于10 ml容量瓶加入乙醚混懸,超聲提取20 min,冷卻至室溫,乙醚補(bǔ)足損失體積,靜置取上清,同法提取兩次,濾液合并,12 000 r/min離心10 min。取上清液過0.45 μm微孔濾膜,1 μl進(jìn)樣GC-MS分析。

    2.1.2 對照品溶液制備分別精密稱取各對照品適量,于10 ml容量瓶中加乙醚至刻度,4℃冰箱中冷藏,備GC-MS分析。

    2.1.3 麝香保心丸灌胃樣品制備精密稱定麝香保心丸樣品適量,研細(xì),于錐形瓶中加入0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液(濃度:0.34 g/ml)。20只SD雄性大鼠隨機(jī)分為溶劑對照組與給藥組,每組10只,溶劑對照組大鼠給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌服。給藥組大鼠給予麝香保心丸混懸液灌服(劑量:3.4 g/kg)。服藥30 min后,所有大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液(劑量:0.15 ml/kg)麻醉。肝門靜脈取血5 ml,置于涂肝素鈉的EP管中,4℃,3 000 r/min離心10 min,取上清液,-80℃冰箱冷凍,備用。

    2.2 色譜條件Thermo TR-5 ms色譜柱;Xcalibur色譜工作站;載氣為氦氣;載氣流速1.0 ml/min;進(jìn)樣口溫度220℃;離子源溫度250℃;進(jìn)樣體積1 μl;梯度升溫程序見表1;分析時間59 min。

    表1 梯度洗脫程序

    2.3 質(zhì)譜條件進(jìn)樣各對照品溶液,優(yōu)化GC-MS參數(shù),優(yōu)化的質(zhì)譜條件:EI源,電子能量70 eV,掃描速度5次/s,發(fā)射電流100 μA,掃描周期3 642 amu/ s,離子源溫度250℃,掃描質(zhì)量范圍10~650 u。數(shù)據(jù)分析采用Xcalibur色譜工作站。

    2.4 入血成分認(rèn)定于5 ml EP管中加入血漿樣品250 μl,乙醚1 ml,渦旋1 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,同法萃取兩次,合并上清,真空旋轉(zhuǎn)蒸干,殘?jiān)尤?0 μl乙醚復(fù)溶,離心,取上清液1 μl進(jìn)樣GC-MS分析,比較溶劑對照組與給藥組質(zhì)譜圖,確定麝香保心丸入血成分。質(zhì)譜鑒定過程:于40~500 u范圍內(nèi),分別對空白血漿,給藥血漿以及麝香保心丸提取液的GC-MS色譜圖以1 μl為間隔單位進(jìn)行提取,即分別提取40、41、42、498、499及500等離子,對提取離子色譜圖進(jìn)行比較,分析空白血漿和給藥血漿離子峰度差異,以此鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果如表2所示。

    2.4.1 原型化合物鑒定由于空白血漿與給藥血漿的質(zhì)譜離子流圖幾乎相同,背景噪音掩蓋了目標(biāo)化合物的響應(yīng)值。為扣除噪音干擾,本研究采用提取離子的方法對空白血漿與給藥血漿圖譜進(jìn)行處理。設(shè)定提取離子波動范圍±0.5u,原型化合物鑒定方法如上所述,如提取離子m/z 55,空白血漿與給藥血漿圖譜如圖1所示。給藥血清圖譜中于36.8 min處出現(xiàn)一差異峰,通過與對照品及NIST05數(shù)據(jù)庫比對,該化合物最終被確定為麝香酮。同理,龍腦、異龍腦、苯甲酸芐酯、肉桂醛及肉桂酸經(jīng)同樣方法鑒定。

    2.4.2 代謝產(chǎn)物鑒定代謝產(chǎn)物鑒定方法如上所述,當(dāng)提取離子為m/z 108時,給藥后血清和空白血清的提取離子色譜圖如圖2所示。通過給藥血漿與空白血漿對比,于保留時間25.7、26.6及26.9 min處的出現(xiàn)3個差異峰,且在麝香保心丸提取液色譜圖中未見,提示其可能為代謝成分。經(jīng)過NIST05數(shù)據(jù)庫比對,3個化合物被鑒定bicycle[2,2,1]heptan-2-ol,2-allyl-1,7,7-trimethyl,2,6,10-trimethyltetradecane及2-butyl-5-methyl-3-[2-methylprop-2-enyl?cyclohexanone。

    表2 GC-MS鑒定的入血成分和代謝產(chǎn)物

    圖1 提取離子m/z 55的空白血漿(A)、給藥血漿(B)色譜圖及差異色譜峰碎片離子圖(C)

    圖2 提取離子m/z 108的空白血漿質(zhì)譜圖

    3 討論

    本文基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對中藥復(fù)方麝香保心丸揮發(fā)性入血成分進(jìn)行研究,共確認(rèn)10個入血成分,包括6個原型成分及4個代謝產(chǎn)物。在已鑒定的這些成分中,很多化合物對心血管疾病有著積極的治療和預(yù)防作用。如肉桂中的肉桂醛能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附因子的產(chǎn)生,可以減少血小板聚集和血栓形成,有利于對抗動脈粥樣硬化[9,10]。麝香酮抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附及其表面ICAM-1、VCAM-1和CD44表達(dá),有利于緩解心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的炎癥反應(yīng)[11]。只含有龍腦和異龍腦的人工冰片則能使冠狀竇血流量回升,減慢心率,降低心肌氧耗量[12]。這些化合物對于心血管積極的治療作用也從另一方面驗(yàn)證了本研究的可靠性。本研究過程中的方法學(xué)優(yōu)化及結(jié)果如下:

    3.1 給藥劑量確定本研究分別考察了不同給藥劑量(0.8、1.7和3.4 g/kg)大鼠血漿中的入血成分,經(jīng)對比GC-MS圖譜主要化合物特征離子(麝香酮m/z 55、肉桂酸m/z 147、龍腦和異龍腦m/z 95)峰度,發(fā)現(xiàn)麝香保心丸中主要的揮發(fā)性成分在3.4 g/kg劑量下的色譜峰較高,所以給藥劑量選擇為3.4 g/kg。

    3.2 取血時間點(diǎn)的確定本研究分別考察了不同取血時間(15、30、60 min)大鼠血漿中的入血成分,從提取特征離子色譜峰中發(fā)現(xiàn),30 min時間點(diǎn)的血漿樣品質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)麝香酮、肉桂酸、龍腦和異龍腦均有色譜峰出現(xiàn),給藥60 min后取血漿樣品質(zhì)譜圖中各目標(biāo)離子的提取離子色譜峰變小,冰片中龍腦、異龍腦的色譜峰甚至消失。所以選擇30 min為最佳時間點(diǎn)。

    3.3 樣品前處理方法優(yōu)化本研究分別考察了不同前處理方法對入血成分的影響,經(jīng)比較,乙醚溶液比正己烷/氯仿(10∶1)混合溶液提取效率要高,正己烷/氯仿(10∶1)混合溶液對麝香酮提取效果較差,所以最終選擇乙醚萃取法作為處理血樣方法。綜上所述,本研究建立了一種快速篩選中藥復(fù)方麝香保心丸中揮發(fā)性入血成分的方法,麝香保心丸藥效物質(zhì)得以最大程度闡釋,這些化合物在機(jī)體的作用靶點(diǎn)和信息調(diào)控機(jī)制將是今后深入研究的重點(diǎn)。通過學(xué)科間的交叉融合,尤其是生物信息學(xué)和生物色譜技術(shù)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的的應(yīng)用有利于揭示中藥藥效物質(zhì)對機(jī)體的調(diào)控機(jī)理,展現(xiàn)中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn),為中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究提供可靠技術(shù)手段。

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    Identification of volatility components of Shexiang Baoxin pill in rat plasma by GC-MS

    GUO Li-ana,WANG Shu-pingb,XIANG Lib,JIANG Pengb,ZHANG Wei-dongb,LIU Run-huib(a.Second Military Medical University,Training Department;b.School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

    ObjectiveTo identify the volatile components in rat serum of Shexiang Baoxin Pill(SBP)by gas chromatography couples with mass spectrometry(GC-MS).MethodsSerum samples from control and SBP administration rats were deproteinated by adding methanol prior to gas chromatography.The separation was carried out on a Thermo TR-5 ms column(30 m×0.25 mm I.D.).The inlet temperature was set at 220℃and ion source temperature was 250℃with gradient warming.The carrier gas was N2 with a gas flow rate of 1.0 ml/min,and the injection volume was 1μl.The total analysis time was 59min.The data acquisition were performed on Xcalibur workstation.ResultsTen components including 6 components from SBP and 4 metabolites were observed from a comprehensive analysis of the chromatography of SBP solution.All the observed components were identified by using the online NIST05 library.ConclusionAn integrated method for screening volatile bioactive components in serum after oral administration of SBP was established,which provided helpful information for further mechanism research.

    Shexiang Baoxin pill;serum pharmacochemistry;coronary heart diseases;GC-MS

    R541.4

    A

    1006-0111(2012)03-0207-04

    10.3969/j.issn.1006-0111.2012.03.013

    2012-04-16

    [修回日期]2012-05-09

    郭黎安(1978-),女,講師.E-mail:gla@smmu.edu.cn.

    柳潤輝.Tel:(021)81871245,E-mail:lyliurh@126.com.

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