聚驅(qū)后油藏產(chǎn)多糖微生物多樣性與功能分析

董 浩，佘躍惠，王正良，舒福昌 （長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北荊州434023）

張 凡，柴陸軍 （中國地質(zhì)大學(xué)（北京）能源學(xué)院，北京100083）

聚驅(qū)后油藏產(chǎn)多糖微生物多樣性與功能分析

董 浩，佘躍惠，王正良，舒福昌 （長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北荊州434023）

張 凡，柴陸軍 （中國地質(zhì)大學(xué)（北京）能源學(xué)院，北京100083）

通過16SrDNA克隆建庫方法對(duì)大慶北二西油藏微生物調(diào)剖過程中和調(diào)剖后4個(gè)不同油井（B2－D4－P45井、B2－4－P47井、B2－4－P49井和B2－5－51井）3個(gè)不同時(shí)間段的樣品經(jīng)選擇富集后的產(chǎn)多糖微生物群落進(jìn)行研究。結(jié)果表明，主要的產(chǎn)多糖菌為愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）和愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis），經(jīng)分離純化得到一株純菌DT－1，與愛媛類芽孢桿菌的16SrDNA序列同源性達(dá)到99%。調(diào)剖過程中主要激活了3類產(chǎn)多糖菌，調(diào)剖1年后微生物多樣性明顯增加，產(chǎn)生物表活劑菌和降解石油烴菌都被共同激活。

聚驅(qū)后油藏；產(chǎn)多糖菌；16SrDNA克隆文庫；愛媛類芽孢桿菌；微生物調(diào)剖

微生物提高石油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR）是生物工程技術(shù)在油田開發(fā)領(lǐng)域開拓性的應(yīng)用，以其成本低、適應(yīng)性強(qiáng)、作業(yè)簡(jiǎn)單、對(duì)地層無傷害和環(huán)保友好性等優(yōu)勢(shì)，尤其是它可以用于聚合物驅(qū)油后的油藏和枯竭油藏的強(qiáng)化采油，在世界上引起廣泛重視，近年來成為石油開采技術(shù)中的熱點(diǎn)［1］。微生物調(diào)剖（Microbial plugging）技術(shù)是通過注入產(chǎn)多糖微生物或激活地層產(chǎn)多糖本源微生物，微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的胞外聚合物、無機(jī)鹽沉淀以及細(xì)胞本身在巖石孔隙表面積累起生物膜，能有效封堵喉道；另外，營(yíng)養(yǎng)劑注入地層后優(yōu)先通過高滲透帶，激活處于高滲透帶的產(chǎn)多糖本源菌生長(zhǎng)，高滲透帶滲透率降低，從而擴(kuò)大注水波及面積，達(dá)到調(diào)剖和提高采收率的目的。美國1984年開展了在聚合物驅(qū)后注入各種微生物調(diào)剖的試驗(yàn)［2］，國內(nèi)大港油田1995年在港西四區(qū)的井組進(jìn)行了聚合驅(qū)后微生物驅(qū)的先導(dǎo)性礦場(chǎng)試驗(yàn)，均取得了一定的效果［3］。

目前大慶油田大規(guī)模采用聚合物驅(qū)等三次采油技術(shù)提高采收率，聚驅(qū)后油層不僅含有約50%的剩余油，還有部分聚合物被吸附和滯留在巖石孔隙及表面上，大量井因高含水或水淹而被迫關(guān)井。而環(huán)保無污染、能源消耗少和吸附引起的化學(xué)劑損失小的MEOR技術(shù)是聚驅(qū)后開采殘余油的一種經(jīng)濟(jì)有效手段。因而研究聚驅(qū)后油藏產(chǎn)多糖微生物群落，分離適合聚驅(qū)后油藏特征的調(diào)剖功能菌及開發(fā)相應(yīng)的調(diào)剖技術(shù)對(duì)延長(zhǎng)大慶油田等以聚合物驅(qū)為主的油田的開采壽命具有重大意義。

筆者采用16SrDNA克隆文庫研究大慶北二西油藏聚驅(qū)后產(chǎn)多糖微生物多樣性，并選擇性分離產(chǎn)多糖菌，為開展微生物調(diào)剖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)水樣

11個(gè)油水樣為北二西油藏微生物調(diào)剖過程3個(gè)不同時(shí)期樣品（表1），該油藏地層溫度為45℃，原始地層壓力為10．91MPa，飽和壓力9．83MPa，破裂壓力13．1MPa，地層水礦化度7000mg／L，油層地下原油粘度9．3mPa·s，平均單井砂巖厚度19．9m，有效厚度12．1m。2008年11月至2009年6月期間在該油藏開展微生物調(diào)剖試驗(yàn)，試驗(yàn)區(qū)示意圖如圖1所示。B2－4－P47井2009－02樣品缺失，2009－05樣品用B2－D4－P47井代替。

表1 2009～2010年產(chǎn)多糖菌克隆文庫對(duì)應(yīng)油井以及采樣時(shí)間編號(hào)

1．1．2 主要藥品和儀器

TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒；DNA純化試劑盒；dNTP；DNA marker（TaKaRa）；27f（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）；1492R（5′－GGC TAC CTT GTT ACG ACT T－3′）；pGEM－T easy vector system（Promega）。

鋼絲繩走線分析:基本單元四邊形N1N2F2F1、M1M2E2E1兩組角線變化基本相同，且單調(diào)遞增，可以依據(jù)曲線變化設(shè)計(jì)鋼絲繩走向。

Sigma 3K15型冷凍離心機(jī)；PTC－200型PCR儀；DYY－5C型電泳儀；Gel－Pro2020D型熒光成像儀；LRH－250生化培養(yǎng)箱。

1．1．3 培養(yǎng)基

產(chǎn)生物多糖聚合物的培養(yǎng)基為糖類2%，磷酸二氫鉀0．2%，硫酸鎂0．1%，硫酸銨0．1%，微量元素適量，pH值為7。

1．2 產(chǎn)多糖微生物的分離

在產(chǎn)多糖培養(yǎng)基中接入5%的樣品，45℃，200r／min培養(yǎng)4d；然后轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)，重復(fù)10輪，挑取產(chǎn)多糖效果較好的3組發(fā)酵液分離純菌，將分出的純菌做斜面保存。

1．3 可培養(yǎng)產(chǎn)多糖聚合物微生物群落的分析

具體方法參見文獻(xiàn)［4］。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2．1 ARDRA結(jié)果和測(cè)序結(jié)果分析

將不同克隆文庫中OTU的代表克隆測(cè)序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中作對(duì)比分析。結(jié)果表明，在B2－D4－P45井3次取的樣品中優(yōu)勢(shì)菌為愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）和愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis），在A1中所占比例分別為64%、25%，A2中分別為11%、47%，A3分別為44%、38%。這幾組樣品富集液的粘稠度較高，初步推斷產(chǎn)多糖菌為這一類的芽孢桿菌。該文庫中微生物的種類少，除了芽孢桿菌和類芽孢桿菌類，在A1中發(fā)現(xiàn)了少量的副球菌（Pannonibacter phragmitetus，1%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，4%），A2中有少量耐鹽弧菌（Vibrio vulnificus，1%），A3中由少量銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，1%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，2%）。

在B2－4－P47井B2樣品中，優(yōu)勢(shì)菌為愛媛類芽包桿菌（Paenibacillus ehimensis，76%）和愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis，21%），富集液的粘稠度較高。在B3中占主導(dǎo)地位的是γ變形菌（Gamma proteobacterium，59%）、紅球菌（Rhodococcus qingshengii，26%）；此外還有少量的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida，7%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，2%）。

在B2－4－P49井3次取得樣品中，C1、C2優(yōu)勢(shì)菌均為芽孢桿菌（Bacillus sp．）、愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis）所占比例分別為52%、30%和49%、21%，C2中還有少量副球菌（Pannonibact－er phragmitetus，5%），在C3中優(yōu)勢(shì)菌為類芽孢桿菌（Paenibacillus，54%），愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis，34%），這3組富集液均粘稠。

在B2－5－51井3次取的樣品中，D1優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌（Bacillus sp．，53%）和愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis，44%）；D2優(yōu)勢(shì)菌為戴沃斯菌（Devosia sp．，59%）和嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，28%），另外有少量的無色菌（Achromobacter sp．，2%）、雌激素降解菌（Estrogen－degrading bacterium，5%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，5%）；D3優(yōu)勢(shì)菌為土壤根癌桿菌（Agrobacterium tumefaciens，94%），此外有少量短波單胞菌（Brevundimonas sp．，1%）、芽孢桿菌（Bacillus siralis，1%）和未培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium，4%）。

2．2 產(chǎn)生物多糖聚合物菌的分離鑒定

通過稀釋涂平板和劃線分離的方法分離得到一株單菌DT－1。將菌株DT－1的16SrDNA序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明該菌株與愛媛芽孢桿菌（Bacillus ehimensis）同源性最近，達(dá)到了99%，被歸為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillus ehimensis［5］。

3 討 論

通過選擇性富集培養(yǎng)和建立16SrDNA克隆文庫的方法，分析了大慶北二西聚驅(qū)后油藏產(chǎn)出液中可培養(yǎng)產(chǎn)聚合物微生物群落組成。實(shí)施微生物調(diào)剖期間，2009年2月和2009年5月樣品OUT都較少，富集發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群大量集中在3個(gè)條帶上，說明微生物調(diào)剖注入產(chǎn)多糖類激活劑主要激活了3類菌。而調(diào)剖試驗(yàn)1年后，注入的產(chǎn)多糖激活劑基本上被消耗完了，因此2010年6月樣品富集后的微生物種類較多。對(duì)比11組試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，富集液粘稠，且產(chǎn)生白色不溶物質(zhì)多的8組樣品中的優(yōu)勢(shì)菌均為愛媛類芽包桿菌（Paenibacillus ehimensis）或芽孢桿菌（Bacillus sp．）；而另外3組發(fā)酵液粘稠度較低，產(chǎn)生的白色不溶物質(zhì)較少，他們的優(yōu)勢(shì)菌為γ變形菌（Gamma proteobacterium，59%），紅球菌（Rhodococcus qingshengii），土壤根癌桿菌（Agrobacterium tumefaciens，94%），戴沃斯菌（Devosia sp．，59%），所以判斷主要的產(chǎn)多糖菌為芽孢桿菌屬。

在富集液粘稠且產(chǎn)生白色不容物質(zhì)多的8組樣品中選取1組分離單菌，對(duì)產(chǎn)多糖菌的分離及分子學(xué)鑒定結(jié)果顯示，分離出的單菌為愛媛類芽孢桿菌；在產(chǎn)多糖培養(yǎng)基中接入該單菌培養(yǎng)，發(fā)酵液變粘稠，產(chǎn)生大量不溶白色物質(zhì)，推斷愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）為主要的產(chǎn)多糖菌。愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）屬于厚壁菌門，能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和其他的水解酶，并能溶解B．sorokiniana細(xì)胞壁［6］。

在A3樣品中發(fā)現(xiàn)了少量的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginos），銅綠假單胞菌可以降解烷烴、脫硫、脫氮和產(chǎn)生表面活性劑降低稠油粘等，是很常見的微生物采油菌，在很多取自不同油田的樣品中均有發(fā)現(xiàn)［7］。短波單胞菌（Brevundimonas sp．）是一種烴降解菌，以往的相關(guān)研究表明，該區(qū)塊聚驅(qū)后產(chǎn)出液中短波單胞菌、銅綠假單胞菌等采油功能菌在群落中占主導(dǎo)地位［8］。該次研究中也發(fā)現(xiàn)了短波單胞菌（Brevundimonas sp．，5．68%），銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginos，1．12%），與以往不同，這些菌在群落中占的比例很小，推測(cè)其原因?yàn)樵诋a(chǎn)多糖培養(yǎng)基中，在和芽孢桿菌的競(jìng)爭(zhēng)中處于了劣勢(shì)，但又能夠在該培養(yǎng)基中存活。D3優(yōu)勢(shì)菌為土壤根癌桿菌，土壤根癌桿菌能夠降解二苯并噻吩（DBT），能夠用于石油脫硫和環(huán)境修復(fù)。

在發(fā)酵液D2中還檢測(cè)到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，26．4%），該菌為專性需氧的非發(fā)酵型革蘭氏陰性極生多鞭毛桿菌，能夠分解利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖等24種物質(zhì)產(chǎn)酸，在血平板上有強(qiáng)的氨味，呈β溶血；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上顯示灰黃色素或無色素，菌落呈針尖狀，直徑0．5～1mm，中央突起。還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，氧化酶陰性，強(qiáng)解脂性，DNase陽性，水解明膠和七葉苷，賴氨酸脫羧酶陽性。有關(guān)該菌用于石油開發(fā)的報(bào)道很少，張竹圓等［9］2011年在遼河樣品中分出該菌，研究表明該菌具有耐堿性，pH適應(yīng)范圍為5～10，同時(shí)也有較好的耐鹽性和耐低溫性，對(duì)C8～C26范圍內(nèi)的正構(gòu)烷烴均有較強(qiáng)的降解作用［10］。

紅球菌（Rhodococcus qingshengii）在B3占有較高的比例，達(dá)到33%，該屬中的Rhodococcus aurantliacus，Rhodococcus erythropolis（紅串紅球菌）等均能產(chǎn)生一種表面活性劑海藻糖脂，具有較好的驅(qū)油性能和洗油效率［11］。其中紅串紅球菌為專一性脫硫菌，能選擇性地脫除苯并噻吩（BT）和DBT及其甲基衍生物4，6－二甲基二苯并噻吩（4，6－DMDBT）中的硫。除此之外，它還可以脫除苯硫醚（PS）和硫醇類含硫化合物中的硫。在正十六烷模擬體系中菌株對(duì)噻吩（TH）、4，6－DMDBT、DBT等類型的硫的降解效率很高，對(duì)BT和PS類硫的降解效率也較好［12］。

11組樣品中微生物的種類都比較少，可能由于大慶油田處于開發(fā)后期，油井高含水，聚合驅(qū)也導(dǎo)致產(chǎn)出液中含有高濃度的聚合物，這些導(dǎo)致能適應(yīng)該環(huán)境的微生物種類較單一；經(jīng)過選擇性培養(yǎng)后能生長(zhǎng)的微生物進(jìn)一步減少。經(jīng)過產(chǎn)多糖培養(yǎng)基選擇富集后的微生物群落較單一，但占優(yōu)勢(shì)地位的多種微生物均為采油功能菌，比如能產(chǎn)生胞外聚合物的愛媛芽孢桿菌，能產(chǎn)生表活劑以及脫硫的紅球菌，能降解石油和還原硝酸鹽的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌等。

4 結(jié)論

1）用16SrDNA克隆建庫方法對(duì)大慶聚驅(qū)后北二西油藏產(chǎn)出液選擇富集后的產(chǎn)多糖微生物群落進(jìn)行研究，表明愛媛類芽孢桿菌等為主要的產(chǎn)多糖菌。

2）分離出了一株產(chǎn)多糖菌DT－1，經(jīng)鑒定為愛媛類芽孢桿菌。

3）其他產(chǎn)多糖微生物為土壤根癌桿菌、紅球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌等。此外共生的菌有產(chǎn)生物表活劑和降解烴類微生物如銅綠假單胞菌、短波單胞菌、惡臭假單胞菌。

［1］Simpson D R，Natraj N R，McInerney M J，et al．Biosurfactant producing Bacillus are present in produced brines from Oklahoma oil reservoirs with a wide range of salinities［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2011，91（4）：1083～1093．

［2］魏兆勝，王嵐嵐，呂振山，等．生物聚合物深部調(diào)剖技術(shù)室內(nèi)及礦場(chǎng)應(yīng)用研究［J］．石油學(xué)報(bào)，2006，27（3）：75～79．

［3］Rebecca S B．World－wide application of microbial technology for improving oil recovery［J］．SPE35356，1996．

［4］Zhang F，She Y H，Zheng Y，et al．Molecular biologic techniques applied to the microbial prospecting of oil and gas in the Ban 876gas and oil field in China［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86（4）：1183～1194．

［5］Jung－Sook L，Yu－Ryang P，Kyung S B．Transfer of Bacillus ehimensis and Bacillus chitinolyticus to the genus Paenibacillus with emended descriptions of Paenibacillus ehimensis comb．nov．a(chǎn)nd Paenibacillus chitinolyticus comb．nov．［J］．Int J Syst Evol Microbiol，2004，54（3）：929～933．

［6］Akiyama K．Purification and gene cloning of a chitosanase from Bacillus ehimensis EAG1［J］．J Biosci Bioeng，1999，87（3）：383～385．

［7］Van Hamme J D，Singh A，Ward O P．Recent advances in petroleum microbiology［J］．Microbiology and Mol Biol Rev，2003，67（4）：503～549．

［8］Zhang Fan，She Yuehui，Ma Shasha，et al．Response of microbial community structure to microbial plugging in a mesothermic petroleum reservoir in China［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2010，88（6）：1413～1422．

［9］張竹圓，白潔，周方，等．兩株河口濕地耐鹽石油降解菌的生物學(xué)特性及降解能力研究［J］．海洋湖沼通報(bào)，2011，25（01）：147～153．

［10］Tiago I，Chung A P，Veríssimo A．Bacterial Diversity in a Nonsaline Alkaline Environment：Heterotrophic Aerobic Populations［J］．Appl．Environ．Microbiol，2004，70（12）：7378～7387．

［11］佘躍惠，易紹金．石油與環(huán)境微生物技術(shù)［M］．武漢：中國地質(zhì)大學(xué)出版社，2002．220～243．

［12］馬挺．Rhodococcus erythropolis DS－3脫硫機(jī)理的研究及脫硫工程菌株的構(gòu)建［D］．天津：南開大學(xué)，2004．

［編輯］ 宋換新

TE327；Q785

A

1000－9752（2012）05－0112－04

2011－12－12

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA06Z204）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（50974022）。

董浩（1987－），男，2009年大學(xué)畢業(yè)，碩士生，現(xiàn)主要從事微生物提高石油采收率方面的研究工作。

佘躍惠，Tel：13501070896；E－mail：sheyuehui＠163．com。