亞低溫治療對(duì)神經(jīng)元興奮性毒性損傷影響的研究

王得文，李愛林

（1.永靖縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅永靖731600；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060）

亞低溫治療對(duì)神經(jīng)元興奮性毒性損傷影響的研究

王得文1，李愛林2*

（1.永靖縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅永靖731600；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060）

目的研究谷氨酸(Glutamate,Glu)對(duì)神經(jīng)元凋亡和細(xì)胞膜損傷的影響，探討亞低溫對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法取孕14 d SD大鼠的胚胎腦組織培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化6 d的神經(jīng)元分為37℃陰性對(duì)照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對(duì)照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實(shí)驗(yàn)組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時(shí)進(jìn)行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實(shí)驗(yàn)組。觀察Bax表達(dá)的變化，測(cè)定甘油(Glycerol，Gly)含量和培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活力。結(jié)果(1)29℃實(shí)驗(yàn)組：Bax表達(dá)29℃組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低；培養(yǎng)液上清中LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。(2)31℃、33℃和35℃實(shí)驗(yàn)組：上清LDH活力、Gly和神經(jīng)元Bax表達(dá)均為37℃陽性組最高，其次為31℃組、33℃和35℃實(shí)驗(yàn)組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。結(jié)論谷氨酸是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜損傷和凋亡的原因之一；31℃～35℃亞低溫治療可以降低凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)，減輕神經(jīng)元細(xì)胞膜的損傷。

亞低溫；谷氨酸；Bax

研究表明谷氨酸(Glutamate，Glu)的興奮性毒性是導(dǎo)致凋亡的重要原因之一[1]，有學(xué)者已經(jīng)對(duì)神經(jīng)損傷后各種藥物的腦保護(hù)作用進(jìn)行了研究[2]。本文通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元的谷氨酸損傷模型，進(jìn)一步研究興奮性毒性對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響以及亞低溫治療對(duì)Glu損傷神經(jīng)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕14 d SD大鼠4只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第四研究所。(2)試劑：纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2，Pepretech公司)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF，Pepretech公司)、Nestin、MAP2、Bax和Bcl2免疫組化試劑盒(中國北京中山公司)。(3)器材：CO2培養(yǎng)箱(IG150，Jouan公司，法國)，倒置相差顯微鏡(NIKON，日本)，三氣培養(yǎng)箱(95%氮?dú)?5%氧氣+ 5%二氧化碳，Heraeus公司，德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)鼠胚胎大腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取孕14 d的SD孕鼠，無菌處理后取胚胎腦組織，加等體積的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，令其消化分散成單細(xì)胞懸液。在IMDM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定在培養(yǎng)第三代胎鼠大腦海馬NSC中干細(xì)胞巢蛋白(nestin)免疫熒光染色陽性，神經(jīng)干細(xì)胞呈球體聚合狀懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)呈圓型，顯示細(xì)胞正處于未分化生長(zhǎng)狀態(tài)，經(jīng)nestin一抗和免疫熒光二抗標(biāo)記呈綠色熒光球體，表明為正常生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。

1.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化上述各組經(jīng)6 d培養(yǎng)后收集細(xì)胞，離心棄上清，各組細(xì)胞重新懸浮于含10%FBS、N2和BDNF(20μg/L)的IMDM培養(yǎng)液中，接種于24孔板(已涂布明膠)，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，用4%多聚甲醛固定30 min，進(jìn)行MAP2免疫組織化學(xué)染色，鑒定分化的神經(jīng)元。

1.2.4 細(xì)胞存活率計(jì)算MAP2陽性率為存活的神經(jīng)元。通過鏡下觀察免疫組化染色可清楚區(qū)分死亡神經(jīng)元和正常神經(jīng)元，這些神經(jīng)元MAP2染色呈陰性，因此在進(jìn)行存活神經(jīng)元計(jì)數(shù)過程中，選擇胞體和突起染色均為陽性并且結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞。

1.2.5 制做Glu損傷模型神經(jīng)干細(xì)胞分化6 d的谷氨酸損傷模型亞低溫實(shí)驗(yàn)分組如下：37℃陰性對(duì)照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對(duì)照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實(shí)驗(yàn)組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時(shí)進(jìn)行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實(shí)驗(yàn)組。

1.2.6 乳酸脫氫酶活力測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH的活力(U/L)=(測(cè)定管OD值-測(cè)定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2 μmol/ml)×1 000 ml×測(cè)定前樣品稀釋倍數(shù)。細(xì)胞中LDH活力(U/gprot)=(測(cè)定管OD值-測(cè)定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2 μmol/ml)÷蛋白濃度(gprot/ml)。

1.2.7 Bax表達(dá)變化的觀察和Gly測(cè)定免疫組化染色(按ABC試劑盒程序)觀察Bax表達(dá)的變化，細(xì)胞呈棕黃色為陽性，陰性則為胞漿無色。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：200×光鏡下，隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域用目鏡網(wǎng)格測(cè)微尺計(jì)算陽性細(xì)胞密度，以陽性細(xì)胞/網(wǎng)格范圍內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以百分率計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，每組數(shù)據(jù)計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。微透析分析儀測(cè)定神經(jīng)元培養(yǎng)液中Gly的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。各種生化成分及比率的組間差異顯著性用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較用S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元及谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的損傷作用

2.1.1 神經(jīng)微管相關(guān)蛋白2(MAP2)免疫組化染色培養(yǎng)6 d的神經(jīng)元經(jīng)MAP2染色，可見胞漿被染成棕黃色，陽性率達(dá)18.21%～22.34%。

2.1.2 谷氨酸對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響在相差顯微鏡下觀察，37℃陽性組細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發(fā)生斷裂，細(xì)胞光暈減弱或消失，細(xì)胞膜增厚、粗糙，部分細(xì)胞死亡崩解。

2.2 亞低溫治療對(duì)Bax、LDH和Gly的影響

2.2.1 29℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果29℃亞低溫治療對(duì)細(xì)胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH(U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達(dá)的影響見表1。Bax表達(dá)29℃亞低溫治療組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低。上清LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。

2.2.2 31℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果31℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療對(duì)細(xì)胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達(dá)的影響見表2。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達(dá)均為37℃陽性組最高，其次為31℃組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。

2.2.3 33℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果33℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療對(duì)細(xì)胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表3。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達(dá)均為37℃陽性組最高，其次為33℃組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為33℃組，37℃陰性組最高。

2.2.4 35℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果35℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療對(duì)細(xì)胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表4。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達(dá)均為37℃陽性組最高，其次為35℃組，37℃陰性組最低；細(xì)胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為35℃組，37℃陰性組最高。

表1 29℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

表1 29℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

項(xiàng)目上清LDH(U/L)細(xì)胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 301.47 567.62 26.17 168.81 37℃陽性602.0±4.27*1116.24±26.60*98.68±24.75*0.38±0.039*37℃陰性586.86±2.90 1670.24±26.60 49.78±11.07 0.12±0.008 29℃649.48±7.64*#837.47±23.68*#120.80±21.83*#0.48±0.056*#0.00 0.00 0.00 0.00

表2 31℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

表2 31℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

項(xiàng)目上清LDH(U/L)細(xì)胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 324.8 187.9 11.71 178.3 37℃陽性557.73±2.67*1217.45±20.97*104.88±12.58*0.38±0.037*37℃陰性534.53±4.77 1398.52±25.10 52.13±15.77 0.12±0.009 31℃516.75±1.11*#1351.72±7.65*#76.64±31.97*#0.21±0.029*#0.00 0.00 0.00 0.00

表3 33℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

表3 33℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

項(xiàng)目上清LDH(U/L)細(xì)胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 21.70 16.20 182.4 37℃陽性747.16±60.97*985.31±19.76*103.61±11.26*0.38±0.040*37℃陰性520.36±16.01 1679.38±28.56 53.41±12.49 0.12±0.009 33℃609.27±9.73*#1235.59±12.65*#73.64±25.72*#0.21±0.027*#0.00 0.00 0.00 0.00

表4 35℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

表4 35℃實(shí)驗(yàn)組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

項(xiàng)目上清LDH(U/L)細(xì)胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 103.3 9.15 50.3 37℃陽性700.52±5.81*1476.28±9.96*110.91±24.28*0.38±0.067*37℃陰性629.89±6.04 1646.15±43.28 68.07±12.72 0.12±0.095 35℃669.85±6.83*#1640.51±13.81*#89.71±21.27*#0.22±0.059*#0.000 0.000 0.001 0.000

3 討論

3.1 Glu損傷模型的建立腦損傷體外模型能消除在體時(shí)各種復(fù)雜因素的影響，觀察某種特定細(xì)胞的病理生理變化，提供一些在體研究不能得到的信息，因此近年來倍受關(guān)注。為探討興奮性毒性物質(zhì)引起腦組織特定細(xì)胞膜損傷的機(jī)制及亞低溫的治療作用，本實(shí)驗(yàn)采用Meade等[3]的Glu損傷模型。

細(xì)胞系對(duì)生長(zhǎng)條件要求較低，易于培養(yǎng)，可以凍存和無限傳代。細(xì)胞系持續(xù)分化的特性表明它們的基因表型和蛋自表達(dá)已與正常的細(xì)胞顯著不同，因此本研究未采用細(xì)胞系作為研究對(duì)象。神經(jīng)元是終末分化細(xì)胞，分離純化十分困難，采用神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)和MAP2免疫組化對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞鑒定的技術(shù)，既可研究Glu對(duì)神經(jīng)元的損傷作用的同時(shí)混合培養(yǎng)又可模擬體內(nèi)真實(shí)的環(huán)境。用新生鼠直接進(jìn)行神經(jīng)元培養(yǎng)，在分離過程中可能造成細(xì)胞損傷且獲得的神經(jīng)元數(shù)量較少，故本研究首先用胎鼠進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，然后通過誘導(dǎo)分化獲得大量混合培養(yǎng)的神經(jīng)元。

本研究成功制作了Glu誘導(dǎo)的凋亡模型。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，37℃陽性組海馬細(xì)胞神經(jīng)元與37℃陰性組神經(jīng)元相比較，細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發(fā)生斷裂，細(xì)胞光暈減弱或消失，部分細(xì)胞死亡崩解。37℃陽性組Bax陽性細(xì)胞率顯著高于37℃陰性組，支持鏡下結(jié)果，證明Glu損傷的神經(jīng)元凋亡促進(jìn)基因表達(dá)活躍。

3.2 Glu的興奮性毒性及亞低溫治療的保護(hù)作用近年研究表明，在退行性疾病(如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病)、腦缺血性損傷和腦創(chuàng)傷后凋亡都參與了腦細(xì)胞死亡的機(jī)制[4]。Bax基因?qū)?xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，本研究選擇Bax蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步深入了解亞低溫治療對(duì)凋亡的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)Glu損傷后的神經(jīng)元表達(dá)顯著高于無Glu損傷的神經(jīng)元，而31℃、33℃和35℃亞低溫治療可以顯著減少因Glu的興奮性毒性所致的Bax表達(dá)，提示亞低溫治療通過抑制Bax表達(dá)而減少損傷神經(jīng)元的凋亡。但29℃低溫治療6 d后，Bax表達(dá)高于未治療的Glu損傷的神經(jīng)元。對(duì)于亞低溫治療的安全溫度窗不同學(xué)者看法不同，Zhao等[5]通過剝奪血清的方法誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，也發(fā)現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，并認(rèn)為29℃低溫治療6 d可產(chǎn)生凍傷作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此作者認(rèn)為應(yīng)慎用29℃的亞低溫治療，并對(duì)治療溫度進(jìn)行更深入的研究。

乳酸脫氫酶的釋放率可以作為細(xì)胞膜損傷的標(biāo)志。正常情況下釋放很少，當(dāng)細(xì)胞膜的通透性增高或完整性喪失時(shí)，LDH擴(kuò)散進(jìn)入胞外介質(zhì)。對(duì)31℃、33℃和35℃組上清中LDH的測(cè)定表明，37℃陽性組LDH最高，其次為31℃、33℃和35℃亞低溫治療組，而37℃陰性組最低；對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH的測(cè)定則相反，37℃陽性組LDH明顯降低，37℃陰性組最高，Gly的變化與LDH相似，表明谷氨酸的興奮性毒性是造成細(xì)胞膜損傷的原因之一，亞低溫治療對(duì)谷氨酸的興奮性毒性造成的細(xì)胞膜損傷具有保護(hù)作用。29℃實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了與其他三組不同的結(jié)果，上清中29℃組LDH最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低，表明6 d的29℃亞低溫治療不但未產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，反而造成了細(xì)胞膜的損傷。Alm等[6]將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞暴露于低濃度的神經(jīng)興奮性毒素，大多數(shù)的細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成等凋亡的形態(tài)學(xué)改變。本研究支持凋亡過程存在細(xì)胞膜的損傷，LDH和Gly的濃度變化提示，凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷可引起Gly濃度升高，支持Gly可作為細(xì)胞膜損傷的標(biāo)記，為臨床通過微透析監(jiān)測(cè)Gly指導(dǎo)治療提供了依據(jù)。

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Effect of hypothermia on cell membrane damage of glutamate-induced hippocampal neurons.

WANG De-wen1, LI Ai-lin2*.1.Department of Neurology,People's Hosptal of Yongjing County,Yongjing 731600,Gansu,CHINA;2. Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Glutamate(Glu)on neuronal apoptosis and cell membranedamage,and analyze the protective effect of hypothermia on neurons.MethodsThe embryonic brain tissue from SD rats with 14 days of pregnancy were extracted and cultured for neural stem cells.After induced differentiation for 6 d, the neurons were divided into 37℃negative control group(with no Glutamate),37℃positive control group(50μmol/L Glutamate),29℃study group(50μmol/L Glutamate),31℃study group,33℃study group,35℃study group.The expression of Bax was observed,and the content of Glycerol(Gly)as well as the activity of Lactate dehydrogenase(LDH) were investigated.Results(1)The express level of Bax was highest in the 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in the culture supernatant and Gly was the highest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and the highest in the 37℃negative control group.(2)The activity of LDH in the culture supernatant,Gly,the expression level of Bax were the highest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,33℃study group,35℃study group,and was the lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,and was the highest in the 37℃negative control group.ConclusionGlutamate is one of the main factors that lead to neuronal apoptosis and cell membrane damage.Hypothermia(31℃～35℃)can inhibit apoptosis and cell membrane damage,and promote the expression of Bax.

Hypothermia;Glutamate;Bax

R454.5

A

1003—6350(2012)22—024—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.008

2012-05-15)

王得文（1969—），男，甘肅省永靖縣人，副主任醫(yī)師。

*通訊作者:李愛林，副主任醫(yī)師，神經(jīng)外科學(xué)博士。E-mail:lailwq@yahoo.com.cn