監(jiān)測血漿EBV-DNA含量在鼻咽癌診療中的意義

柳文菊，杜昆

（長江大學附屬第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北荊州434000）

監(jiān)測血漿EBV-DNA含量在鼻咽癌診療中的意義

柳文菊，杜昆

（長江大學附屬第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北荊州434000）

目的探討鼻咽癌患者放化療過程中血漿EBV-DNA含量在臨床診療中的意義。方法采用熒光定量PCR法檢測50例NPC患者在不同的診療階段血漿EBV-DNA的含量，同時設(shè)50例健康體檢者為陰性對照組。結(jié)果50例NPC組中EBV-DNA檢測陽性率為92.0%（46/50），健康對照組陽性率為8.0%（4/50）；46例EBV-DNA陽性的患者中，26例患者從第一周治療開始，DNA水平就開始明顯下降，至治療結(jié)束前已檢測不到DNA的復制；14例患者開始幾周DNA水平變化并不明顯，至治療結(jié)束前，基本檢測不到DNA的復制；6例患者在治療過程中均可檢測到較高水平的EBV-DNA。結(jié)論采用熒光定量PCR方法檢測NPC患者血漿中游離的EBV-DNA是一種敏感可靠的方法，對于NPC的早期診斷及預后具有非常重要的臨床意義。

熒光定量PCR；鼻咽癌；EBV-DNA；血漿

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種普遍存在的皰疹病毒群，感染后能累及機體全身各個器官系統(tǒng)[1-2]，其中以侵犯造血系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)最為常見，可引起各種惡性腫瘤，從而嚴重危害人類生命健康。鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方常見的一種惡性腫瘤，其具體的發(fā)病機制仍然不清楚，但目前認為NPC的發(fā)生與EBV感染有關(guān)[3-4]。自Mutirangura等[5]報道NPC患者血漿中可檢測到EBV-DNA以來，許多學者都進行了這方面的研究，并證實NPC患者血漿EBV-DNA量的含量能夠反映體內(nèi)腫瘤負荷情況[6-7]。我們采用TaqMan探針熒光定量PCR技術(shù)對50例已確診為鼻咽癌的患者血漿EBV-DNA進行定量檢測，探討鼻咽癌患者放化療過程中血漿EBV-DNA含量在臨床診療中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2009年1月至2011年2月間入住我院腫瘤分院經(jīng)初診確診為鼻咽癌的患者50例。年齡27～65歲，平均47.6歲。其中男性38例，女性12例。所有的患者均接受同期放化療。放射治療按照臨床檢查和CT/MRI示腫瘤范圍設(shè)野，并按臨床常規(guī)進行?；熍c放療同時進行，采用草酸鉑70 mg/m2每周一次連續(xù)6周。放化療期間，每周用間接鼻咽鏡檢查鼻咽腫物1～2次，同時密切注意頸淋巴結(jié)腫脹的消退情況。治療結(jié)束后2～3個月復查鼻咽CT或MRI、胸片、腹部B超等以評價療效。療效的評價依據(jù)WHO實體瘤評價標準進行。另采集50例健康體檢者血樣（由體檢中心負責抽?。┳鳛殛幮詫φ战M。兩組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 血漿標本的采取每位受檢者每次抽取血外周血3 ml，加入到EDTA抗凝管中，2 000 rpm離心5 min，吸取200 ul血漿于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EBV-DNA的提取及擴增將凍存的血漿復融后放置至室溫，嚴格按照中山大學達安基因股份有限公司提供的EBV熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行DNA的提取。吸取抽提的DNA入PCR的反應(yīng)管中，在德國產(chǎn)Agilent Technologies Stratagene Mx3000P全自動擴增儀上擴增。擴增程序如下：93℃3 min，再93℃45 s、55℃2 min，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后結(jié)果由計算機進行數(shù)據(jù)處理，以IU/ml報告，小于檢測下限5.0×102IU/ml結(jié)果判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用方差分析，非正態(tài)分布的計量資料采用秩和檢驗。兩組間EBV-DNA陽性率比較采用卡方檢驗，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組和健康對照組血漿EBV-DNA陽性檢出率結(jié)果如表1所示，50例鼻咽癌患者中共檢出46例EBV-DNA陽性患者，而50例健康對照組中檢出4例EBV-DNA陽性，兩組統(tǒng)計學比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 放化療后不同時期血漿EBV-DNA水平46例EBV-DNA陽性鼻咽癌患者在治療后不同時期檢測血漿EBV-DNA含量，發(fā)現(xiàn)40例在治療后EBV-DNA含量逐漸減少，至第6周完全檢測不到EBV-DNA；另外6例在治療過程中均能檢測到EBV-DNA。

表2 46例EBV-DNA陽性患者治療期間血漿EBV-DNA水平(IU/ml)

2.3 血漿EBV-DNA動態(tài)變化與療效的關(guān)系治療前，92%（46/50）的患者血漿中可檢測到較高水平的EBV-DNA，8%（4/50）患者未檢測出EBV-DNA。46例EBV-DNA陽性的患者中，26例患者從第一周治療開始，DNA水平就開始呈明顯下降，到第4周至第5周，就基本已經(jīng)檢測不到DNA的復制。14例患者開始幾周DNA水平變化并不明顯，但到治療結(jié)束前1～2周，也基本檢測不到DNA的復制。對這40例患者在治療結(jié)束后進行一系列相關(guān)檢查，確定為完全緩解，而另外6例在治療過程中均能檢測到EBV-DNA，在治療結(jié)束后進行相關(guān)檢查，發(fā)現(xiàn)這6例患者均有腫瘤殘留，其中2例為顱內(nèi)殘留，4例示淋巴結(jié)殘留。

3 討論

長期以來，檢測EB病毒相關(guān)抗原抗體如殼抗原IgA抗體(VCA-IgA)、早期抗原IgA抗體(EA-IgA)等是篩查、輔助診斷和監(jiān)測鼻咽癌病情變化的主要方法[8]。有研究表明VCA-IgA滴度水平在放療中不隨腫瘤的消退而下降，提示抗體檢測不能精確反映體內(nèi)腫瘤負荷。由于VCA-IgA半衰期較長，即使體內(nèi)EB病毒被清除，在較長一段時間內(nèi)血液中仍可檢出該抗體，故VCA-IgA不能準確反映鼻咽癌病情變化的情況[9]。

由于鼻咽癌患者血漿或血清中可檢測出EBV-DNA，本研究通過用熒光定量PCR技術(shù)檢測50例鼻咽癌患者血漿中EBV-DNA水平，46例（92%）陽性[中位濃度為（5.23±5）IU/ml]；而在50例對照組中，僅4例（8%）陽性（中位濃度為0 IU/ml），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這一結(jié)果與Lo等[10]的研究結(jié)果一致，表明檢測血漿EBV-DNA是一種敏感有效的初治篩選NPC的方法。

目前，監(jiān)測NPC患者腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)的方法主要依靠常規(guī)體檢、間接鼻咽纖維鏡和影像學檢查，但這些方法的敏感性和特異性較差、檢測過程繁瑣、費用昂貴、發(fā)現(xiàn)不及時以及不能明確區(qū)分腫瘤病灶為原發(fā)病灶還是轉(zhuǎn)移病灶等問題。而PCR定量檢測NPC患者在治療不同階段的血漿EBV-DNA含量，能夠給臨床提供快速和準確的療效觀察。本研究中，46例EBV-DNA陽性患者中，40例患者經(jīng)治療后，血漿中檢測不到EBV-DNA，同時其癥狀也得到緩解，腫瘤消退；而另外6例患者，在治療過程中均能檢測到EBV-DNA，其癥狀緩解不明顯，有腫瘤殘留。這表明NPC患者治療后EBV-DNA的含量能很好的反映患者病情變化，這對NPC患者的療效及預后判斷具有非常重要的臨床意義。

綜上所述，采用熒光定量PCR方法檢測血漿中游離的EBV-DNA，對于NPC的早期診斷、療效及預后判斷具有重要的臨床意義，尤其是對高危地區(qū)和高危人群的鼻咽癌篩查和鼻咽癌患者的預后有重要的實用價值。

[1]OkanM.Overview and problematic standpoints of severe chronic activeepslein-barr virlis infection syndrome[J].OncolHematol, 2002,44(4)：273-282.

[2]易世紅,蘇盈盈,張國梁.EB病毒檢測及EB病毒感染相關(guān)疾病的分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2009,19(1)：26-27.

[3]Feng P,Chan SH,Soo MY,et al.Antibody response to Epstein-Barr virus Rta protein in patients with nasopharyngeal carcinoma：a new serologic parameter for diagnosis[J].Cancer,2001,92：1872-1880.

[4]林欽塘.EB病毒感染與鼻咽癌發(fā)病機制的關(guān)系[J].癌癥,2009,8：791-804.

[5]Mutirangura A,Pornthanakasem W,Theamboonlers A,et al.Epstein-Barr viralDNA in serum of patientswith naso-pharyngeal carcinoma[J].Clin Cancer Res,1998,4(3)：665.

[6]李多杰,彭開桂,江浩.血漿EBV DNA定量分析在監(jiān)測鼻咽癌患者復發(fā)和轉(zhuǎn)移中的價值[J].實用腫瘤雜志,2008,23(1)：12-15.

[7]葉新芊,李金高,龔曉昌,等.鼻咽癌血漿EB病毒DNA水平與腫瘤負荷的關(guān)系[J].實用癌癥雜志,2007,22(2)：147-149.

[8]唐國全,周向陽,陽春茂.EB病毒IgA滴度在鼻咽癌診斷的敏感性和特異性[J].廣西醫(yī)學,2008,30(6)：831-832.

[9]羅耀凌,歐國萍,池沛冬,等.聯(lián)合檢測EB病毒相關(guān)抗體和抗原對診斷鼻咽癌的價值[J].癌癥,2009,28(1)：96-99.

[10]Lo YM,Chan LY,Lo KW,et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res,1999,59(6)：1188-1191.

Clinical significance of plasma Epstein-Bar virus DNA concentration in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma.

LIU Wen-ju,DU Kun.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Yangtze University,Jingzhou 434000,HuBei,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical significance of plasma Epstein-Bar virus DNA (EBV-DNA)concentration in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma(NPC).MethodsFluorescence quantitative PCR was used to determine the content of EBV-DNA in blood serum in 56 patients with NPC(the study group)and 50 healthy individuals(the control group).ResultsThe positive rate of EBV-DNA was 92%(46/ 50)in the study group and 8%(4/50)in the control group.Among the 46 patients detected positive in the study group, 26 patients were detected with significantly decreased EBV-DNA at the first week of treatment,and with no EBV-DNA at the end of the treatment.Fourteen patients were detected with high levels of EBV-DNA at the initial weeks of treatment,but with no EBV-DNA at the end of the treatment.Six patients were found to maintain a high levels of EBV-DNA throughout the treatment.ConclusionDetermination of EBV-DNA by fluorescence qualitative PCR in blood serum is reliable and sensitive,which has high clinical value in the diagnosis and treatment of NPC.

Fluorescence qualitative PCR;Nasopharyngeal carcinoma;EBV-DNA;Plasma

R739.63

A

1003—6350（2012）18—007—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.003

2012-03-19）

柳文菊（1971—），女，湖北省荊州市人，主管技師，學士。