HPLC法測定四川朱砂蓮生品及不同炮制品中馬兜鈴酸A含量

任華忠(樂山職業(yè)技術學院 藥學系，四川 樂山 614000)

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HPLC法測定四川朱砂蓮生品及不同炮制品中馬兜鈴酸A含量

任華忠
(樂山職業(yè)技術學院 藥學系，四川 樂山 614000)

目的：研究不同炮制方法對四川朱砂蓮中馬兜鈴酸A含量的影響。方法：采用4種不同的炮炙去毒方法對朱砂蓮樣品進行處理后，采用HPLC法對其馬兜鈴酸A的含量進行檢測，并與生品中所含馬兜鈴酸A的含量進行分析比較。色譜條件：色譜柱為Agilent-C18柱(4.6mm×150mm,3.5μm)，流動相：0.1%碳酸銨溶液-乙腈(72∶28)，流速：1mL·min-1，檢測波長250nm，柱溫為28℃。結果：除蒸制組外，經蜜炙、甘草汁炙、堿水炙處理的四川朱砂蓮樣品與生品比較，馬兜鈴酸A的含量差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.01),變化率超過80%。結論：蜜炙、甘草汁炙、堿水炙在四川朱砂蓮的炮制處理中起到了很好的減毒作用。

朱砂蓮；炮制；馬兜鈴酸；高效液相色譜

朱砂蓮為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物四川朱砂蓮AristolochiacinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu的干燥塊根，是我國西南各省民間習用的一種止痛中藥[1，2]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為朱砂蓮性味苦、辛、寒，具清熱解毒、消炎止痛之功效，在民間廣泛用于治療牙痛、胃痛、關節(jié)痛，現(xiàn)代藥理研究表明其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等作用。但近年來時有關于朱砂蓮腎毒性的報道[3]，朱砂蓮使用安全性的質疑越來越大。其安全性問題的根源在于所含的馬兜鈴酸類物質[4]，同時也跟超劑量使用等不合理用藥方法有關[5]，有研究指出可以通過合理配伍和炮制方法減輕和控制其毒性[6,7]?；诖耍P者采用傳統(tǒng)中藥炮制去毒方法處理朱砂蓮，并以HPLC法測定生品及各個炮制品中馬兜鈴酸A的相對含量，為朱砂蓮的炮制去毒及合理使用提供參考依據。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀，包括自動脫氣機、自動進樣器、二元泵、柱溫箱、996型二極管陣列檢測器、Millennium32色譜工作站(美國Waters公司)；UV-3010型紫外-可見分光光度計(日本日立公司)；PHS-2F型臺式pH計(上海雷磁公司)；KS150D型超聲波清洗器(深圳潔威公司)。

馬兜鈴酸A對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號110746-200406)。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

朱砂蓮藥材購于四川省峨眉山市中藥材集市，經香港浸會大學鄔家林教授鑒定為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物四川朱砂蓮(A.cinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu)的塊根。

2 方法與結果

2.1 樣品處理

生品：取凈制后的朱砂蓮曬至完全干燥，為1號樣品。蒸制品：取凈制后的朱砂蓮蒸至透心，烘干，為2號樣品。蜜炙品：取凈制朱砂蓮按照《中藥藥典》附錄藥材炮制通則[7]記載的方法進行蜜炙(100g凈藥材，用煉蜜25g)，為3號樣品。堿水炙品：取凈制朱砂蓮按照文獻[8]方法進行堿水炙(100g凈藥材，用碳酸鈉2g)，為4號樣品。甘草汁炙品：取凈制朱砂蓮，按照文獻[8]方法進行甘草汁炙(100g凈藥材，用甘草6g)，為5號樣品。1～5號樣品各設3個平行組。

2.2 馬兜鈴酸A含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取馬兜鈴酸A對照品適量，加乙醇溶解，制成0.052mg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入乙醇100mL，稱定重量，回流提取2h，放冷，再次稱定重量，分別用溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，離心，取上清液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18柱(4.6mm×150mm, 3.5μm)，流動相：0.1%碳酸銨溶液-乙腈(72∶28)，流速：1mL·min-1，檢測波長為250nm，柱溫為28℃。在此色譜條件下，各樣品溶液中馬兜鈴酸A與其他組分能達到基線分離，見圖1。

2.2.4 線性關系 精密吸取濃度為0.052mg·mL-1的對照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL，用乙醇稀釋并定容至10mL。在上述色譜條件下進樣10μL進行測定，記錄色譜圖，測定其峰面積，以峰面積(y)為縱坐標，馬兜鈴酸A量(x)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y=141 099x+35 174,r=0.999 8(n=7)，線性范圍為52～364ng/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密量取馬兜鈴酸A對照品溶液，加乙醇稀釋至0.26mg·mL-1。精密吸取該對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定馬兜鈴酸A峰面積，結果RSD為1.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取該對照品溶液，在室溫下自然放置，分別于0、1、4、8、12、24h進行測定。結果6次測得馬兜鈴酸A峰面積的RSD為1.35%，表明對照品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.2.6 重復性試驗 取樣品約1g，共6份，精密稱定，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并測定。結果6次測得馬兜鈴酸A含量的RSD為1.43%。表明測定方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取本品約1g，共6份，精密稱定，分別置圓底燒瓶中，各精密加入一定量的馬兜鈴酸A對照品，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并測定，結果見表1。

圖1 馬兜鈴酸A對照品(A)、供試品(B)HPLC圖譜

表1 加樣回收率試驗結果

2.2.8 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標法計算含量，結果見表2。

表2 朱砂蓮生品與不同炮制品馬兜鈴酸含量測定結果 (n=3)

3 討論

四川朱砂蓮的使用受到很大限制的根本原因是其所含馬兜鈴酸可造成腎損害，而據目前的文獻資料，馬兜鈴科中藥的腎毒性受劑量高低、療程長短、個體差異、炮制方法等因素影響。本研究中，蒸制品與生品相比，馬兜鈴酸A含量差異較小，而三組炙品與生品之間比較，馬兜鈴酸A含量差顯著異，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。另外，不同的炮制去毒方法對馬兜鈴酸含量影響十分明顯。其中蜜炙、甘草汁炙、堿水炙三種炮制方式起到了較好的去毒作用。近年來不斷有四川朱砂蓮毒性反應報道，應該采取謹慎使用的態(tài)度，可通過炮制去毒和改變用藥途徑等方面的研究來探索其合理使用的可能性。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M]. 上海:上?？茖W技術出版社,1998.

[2] 鄔家林.朱砂蓮的考證[J].中藥材，1985(5):46.

[3] 黃仁發(fā).朱砂蓮中毒致急性馬兜鈴酸腎病[J].藥物不良反應雜志，2007, 9(6):412.

[4] 徐曉月,張陸勇,江振洲.馬兜鈴酸I腎毒性的實驗研究[J].中國生化藥物雜志，2006,27(6):336.

[5] 梅全喜,高玉橋,胡世林.應理性對待含馬兜鈴酸類中藥[J].中國藥房，2006,17(7):554.

[6] 劉雅婧.細辛中馬兜鈴酸的炮制脫毒研究[D].吉林:吉林農業(yè)大學,2008.

[7] 中國中醫(yī)科學院中藥研究所. 一種去除中藥中馬兜鈴酸的方法及其限量標準：中國，CN 1O1264116A[P].2007-3-14.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學工業(yè)出版社,2010.

[9] 唐廷猷.中藥炮制學[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1997:137.

[10] 路金才,韓娜,杜曉曦,等.馬兜鈴酸的測定方法現(xiàn)狀分析[J].中草藥，2006,37(7):1113.

[11] 胡芳,潘金火.關木通及其炮制品中馬兜鈴酸A的含量變化[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3):672.

(責任編輯：魏 曉)

Determination of the Content of Aristolochic Acid-Ain processed Aristolochia Cinnabarina by HPLC

Ren Huazhong
(Leshan Vocational & Technical college,Leshan 614000,China)

Objective:To research the content changes of Aristolochic Acid-A in processedAristolochiaCinnabarina. Methods:Columnhypersil Agilent-C18(4.6mm×150mm,3.5μm).Mobile phase:Solution of acetonitrile and ammonium carbonate(72∶28),detection wavelength: 250nm,flow rate:1.0mL/min,the column temperature was 28℃. Results:Except by steamed AristolochiaCinnabarina, there was significant difference between products that processed by honey, succus liquiritiae or sodium carbonate and raw materials of aristolochic acid A content by the rate of more than 80%(P<0.01). Conclusion:Processed by honey, succus liquiritiae or sodium carbonate played a good role in disintoxication of Aristolochia Cinnabarina.

AristolochiaCinnabarina；Processing Technique；Aristolochic Acid-A;HPLC

2015-01-12

樂山職業(yè)技術學院科研課題(KY2013034)；樂山市科技局重點研究計劃(14SZB248)

任華忠(1981-)，男，樂山職業(yè)技術學院講師，研究方向為天然活性產物和中藥質量標準。

R284

A

1673-2197(2015)11-0023-02

10.11954/ytctyy.201511010