牛奶和嬰兒配方奶粉中三聚氰胺篩選和定量方法——ELISA，HPLC-UV，GC-MS和LC-MS/MS的驗(yàn)證和測定效果（四）

文 / 季 昀 龐學(xué)燕 譯

（江蘇揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）

▲ 接本刊2012年第9期

3.4 LC-MS/MS法工作特性

圖5 三聚氰胺LC-MS/MS子離子掃描結(jié)果（上色譜圖）和[ 13C3， 15N3 ]-三聚氰胺LC-MS/MS子離子掃描結(jié)果（下色譜圖）

一個簡單樣本的前處理限用于權(quán)衡在乙腈/水介質(zhì)中的樣本含量，然后通過蛋白質(zhì)沉淀，用單一容器進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，以避免任何清洗和濃縮步驟的固相萃取（SPE），防止受到不同接觸材料的意外交叉污染。通過將1 g樣本溶于50 mL乙腈/水（70∶30， v/v）介質(zhì)中構(gòu)成了最適條件（Desmarchelier et al，2009）。

通過HILIC TSKgel 氨基-80柱和ZIC-HILIC 柱可以獲得最佳的色譜分離效果。數(shù)據(jù)是使用TSKgel 氨基-80柱產(chǎn)生的。最優(yōu)化的色譜條件主要鑒于達(dá)到至少2 倍于柱的空體積的保留時間（RT）。監(jiān)測轉(zhuǎn)換結(jié)果顯示了三聚氰胺最常見的碎片m/z 127→85和m/z 127→68。離子m/z 85的形成類似于損失的氨腈從[M+H]+離子形成2，4-二氨基-1，3-二氮雜環(huán)丁二烯陽離子，而m/z 68離子形成于隨后的氨的損失（Varelis和Jeskelis，2008）（圖5）。其中上色譜圖為三聚氰胺LC-MS/MS子離子掃描結(jié)果，結(jié)果顯示了母體化合物（M+H）+在m/z 127和與之相關(guān)的子離子，例如m/z 85，68和43，下色譜圖為[，]-三聚氰胺LC-MS/MS子離子掃描結(jié)果，結(jié)果顯示了母體化合物（M+H）+在m/z 133和與之相關(guān)的子離子，例如m/z 89，71。三聚氰胺和（13C3，15N3）標(biāo)記的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）破碎條件最優(yōu)化。以正離子模式記錄全掃描譜顯示最突出的離子，對于三聚氰胺和（13C3，15N3）-三聚氰胺分別為m/z 127和m/z 133。選擇用于定量和特征鑒定的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，結(jié)果見表2。含有內(nèi)標(biāo)的MBPIF中添加1 mg/kg三聚氰胺TIC色譜圖見圖6，圖中有檢測離子的離子色譜圖，對于未標(biāo)記種類和它的同位素標(biāo)記物，檢測三聚氰胺轉(zhuǎn)化反應(yīng)分別為127.0→85.1，127.0→68.0和133.0→89.1，133.0→71.1。基質(zhì)效應(yīng)已由Desmarchelier等于2009年詳細(xì)評價?？傊?，CM和MBPIF中預(yù)期的保留時間未受到干擾，而且通過添加內(nèi)標(biāo)物使基質(zhì)效應(yīng)得到了很好的彌補(bǔ)。

通過以批間精密度（iR）為基礎(chǔ)獲得的6 個不同的外標(biāo)曲線來測試線性度。CM和MBPIF測試的線性度覆蓋范圍分別在0～0.200 mg/kg和0～2.000 mg/kg之間。這2 個濃度范圍的校正曲線都遵循線性模型，殘留物均勻分布，并且響應(yīng)系數(shù)穩(wěn)定在考慮的濃度范圍內(nèi)。

CM和MBPIF中的三聚氰胺LOD值為0.05 mg/kg（信噪比等于3）。本試驗(yàn)對CM中3 個不同濃度水平和MBPIF中6 個不同濃度的三聚氰胺測定了重復(fù)性、批間精密度范圍和回收率，并總結(jié)于表4中（見2012年第8期）。

圖6 MBPIF中按1 mg/kg添加三聚氰胺（MEL）和它的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品（MEL-IS）LC-ESI MS/MS色譜圖

表5 雀巢P-檢驗(yàn)三聚氰胺結(jié)果 單位：mg/kg

3.5 測試效果

雀巢的P-檢驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA、HPLC-UV、GC-MS、LCMS/MS在以牛奶為原料的嬰兒配方奶粉三聚氰胺含量水平檢測方面具有相似的結(jié)果（表5）。對于每種不存在偏差的方法而言，平均值和中位數(shù)（用ELISA分析樣本C最高為17%）之間的最小差值能夠合理化。中值和指定值之間的微差值證明，ELISA測定結(jié)果有過高的評價。相反，在三聚氰胺濃度水平大于1 mg/kg時，HPLC-UV測定結(jié)果偏低。但是，這種偏差是有限的，因?yàn)榛谥形粩?shù)和指定值之間的比較，對于樣本C和樣本D分別為-9.8%和-7.8%。試驗(yàn)通過在IRMM P-測驗(yàn)獲得的結(jié)果來鑒定這些觀察值。脫脂奶粉和烘干的混合樣本用z-分值證明，通過計(jì)算 2 < z < 2則為極好的測定結(jié)果（表6）。

3.6 決定值和檢測能力

WHO已規(guī)定，相對于每日可忍受攝取量來說，限制以牛奶為原料的嬰兒配方食品（1 mg/kg）和其它食品（2.5 mg/kg）中三聚氰胺的含量具有足夠的安全系數(shù)。按照之前材料與方法部分描述的對MBPIF使用LC-MS/MS法計(jì)算的CCα結(jié)果為1.03 mg/kg，CCβ計(jì)算結(jié)果為1.05 mg/kg。

表6 IRMM P-檢驗(yàn)三聚氰胺測定結(jié)果 單位：mg/kg

4 結(jié)論

商購的ELISA試劑盒為三聚氰胺提供了半定量檢測方法，同時可以快速檢測三聚氰胺的幾個平行分析樣本，但是，由于樣本基質(zhì)的干擾以及相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)造成存在假陽性結(jié)果的可能使得這種技術(shù)受到限制。LC結(jié)合UV或DAD檢測通常用于食品中三聚氰胺的檢測并且具有足夠的與規(guī)定一致的敏感性。然而，從樣品前處理和色譜條件來講，如果這種方法沒有得到正確的驗(yàn)證，那么許多有機(jī)化合物在240 nm處吸收紫外線的事實(shí)將導(dǎo)致錯誤的定量或者過高估計(jì)三聚氰胺的含量，因?yàn)槿矍璋返蔫b定不僅需要保留時間而且需要觀察吸收光譜。研究表明，GC和質(zhì)譜分析法結(jié)合用于三聚氰胺的鑒定（全掃描模式）以及定量（SIM模式）提高了分離度并且可用于定量檢測以及鑒定像MBPIF這樣的產(chǎn)品中三聚氰胺的殘留。通過LC-MS/MS實(shí)現(xiàn)了最高的分離度和可靠性，LC-MS/MS通過以選擇反應(yīng)監(jiān)測為基礎(chǔ)獲得三聚氰胺的含量以及碎片水平的定量來保證檢測的分離度，防止錯誤定量。本文提出的所有方法在雀巢P-檢測以及IRMM P-檢測中都展現(xiàn)出了它們各自的優(yōu)勢。

[1]Bradley E L，Boughtflower V，Smith T L，et al. Survey of the migration of melamine and formaldehyde from melamine food contact articles available on the UK market. Food Additives and Contaminants，2005，22（6）：597-606.

[2]Commission Decision 2002/657/EC.Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities，2002（L221）：8-36.

[3]Commission Directive 2002/72/EC.Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities，2002（L220）：18-58.

[4]Cruywagen C W，Stander M A，Adonis M，et al. Pathway confirmed for the transmission of melamine from feed to cow’s milk. Journal of Dairy Science，2009（92）：2046-2050.

[5]Desmarchelier A，Guillamon-Cuadra，M，Delatour，T，et al. Simultaneous quantitative determination of melamine and cyanuric acid in cow’s milk and milk-based infant formula by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（16）：7186-7193.

[6]Dobson R L M，Motlagh S，Quijano M，et al. Identification and characterization of toxicity of contaminants in pet food leading to an outbreak of renal toxicity in cats and dogs. Toxicological Sciences，2008（106）：251-262.

[7]Ehling S，Tefera S，Ho I P. Highperformance liquid chromatographic method for the simultaneous detection of the adulteration of cereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline，ammelide，and cyanuric acid. Food Additives and Contaminants，2007，24（12）：1319-1325.

[8]Garber E A. Detection of melamine using commercial enzyme-linked immunosorbent assay technology. Journal of Food Protection，2008（71）：590-594.

[9]Heller D N，Nochetto C B. Simultaneous determination and confirmation of melamine and cyanuric acid in animal feed by zwitterionic hydrophilic interaction chromatography and tandem mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry，2008（22）：3624-3632.

[10]Ishiwata H，Inoue T，Yamazaki T，et al. Liquid chromatographic determination of melamine in beverages. Journal of Association of Official Analytical Chemists，1987（70）：457-460.

[11]ISO 5725-6. Accuracy（trueness and precision）of results and test methods.Part 6：Practical use of accuracy values.Geneva Switzerland：International Standards Organization. 1994.

[12]Kim B，Perkins L B，Bushway R J，et al. Determination of melamine in pet food by enzyme immunoassay，high-performance liquid chromatography with diode array detection， and ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Journal of AOAC International，2008，91（2）：408-413.

[13]Lund K H，Petersen J H. Migration of formaldehyde and melamine monomers from kitchen and tableware made of melamine plastic.Food Additives and Contaminants，2006，23（9）：948-955.

[14]Martin R E，Hizo C B，Ong A M，et al.Release of formaldehyde and melamine from tableware manufactured in the Philippines.Journal of Food Protection，1992，55（8）：632-635.

[16]Patakioutas G，Savvas D，Matakoulis C，et al. Application and fate of cyromazine in a closed-cycle hydroponic cultivation of bean（Phaseolus vulgaris L.）. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007（55）：9928-9935.

[17]Rodriguez M，Orescan D B. Confirmation and quantitation of selected sulfonylurea，imidazolinone，and sulfonamide herbicides in surface water using electrospray LC/MS.Analytical Chemistry，1998（70）：2710-2717.

[18]Smoker M，Krynitsky A J. Interim method for determination of melamine and cyanuric acid residues in foods using LC-MS/MS：Version 1.US Food and Drug Administration. 2008.

[19]Vail T M，Jones P R，Sparkman OD. Rapid and unambiguous identification of melamine in contaminated pet food based on mass spectrometry with four degrees of confirmation.Journal of Analytical Toxicology，2007，31（4）：304-312.

[20]Varelis P，JeskelisR. Preparation of]-melamine and []-cyanuric acid and their application to the analysis of melamine and cyanuric acid in meat and pet food using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Food Additives and Contaminants，2008（25）：1208-1215.

[21]World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations.Expert meeting to review toxicological aspects of melamine and cyanuric acid. 2008.

[22]Yokley R A，Mayer L C，Rezaaiyan R，et al. Analytical method for the determination of cyromazine and melamine residues in soil using LC-UV and GC-MSD. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000（48）：3352-3358.

[譯自Food Control，2011（22）：903-913]

（續(xù)完）