設(shè)施菜田土壤剖面中的反硝化特征

宋賀，徐新超，王敬國，陳清，郭景恒，王進(jìn)闖

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

生物反硝化過程是農(nóng)田氮素?fù)p失的重要途徑［1］，它產(chǎn)生的N2O、NO等氣體會對臭氧層產(chǎn)生危害［2-3］，并會產(chǎn)生一定的溫室效應(yīng)［4］。該過程受到氧分壓、含水量、有機(jī)碳和含量等因素的影響［5-6］。農(nóng)田管理措施中，灌溉會通過增大土壤的含水量，改變土壤通氣狀況和氧分壓影響反硝化過程。當(dāng)土壤孔隙含水量超過60%時，反硝化過程會受到強(qiáng)烈的影響［7］。施肥則是通過為反硝化微生物提供能源、電子供體和底物來影響反硝化過程［8］?？偟膩碚f，水肥投入將會促進(jìn)反硝化過程的進(jìn)行［9-10］。

農(nóng)業(yè)實(shí)踐中，常會給菜田特別是設(shè)施菜田投入過量的水肥。隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，設(shè)施蔬菜種植已逐漸成為我國蔬菜的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，其種植面積已從上個世紀(jì)八十年代初的0.7萬公頃，增加到了2008年的334.7萬公頃，增加了近500倍［11-12］。但大部分的設(shè)施菜田，每年化肥氮和有機(jī)肥的投入量多會超過每公頃1200 kg和10 t，灌溉量也常會超過1000 mm［13-15］。過量的有機(jī)碳、氮和水投入，將促進(jìn)反硝化的進(jìn)行，增大 N2O、NO等氣體的排放。Ryden和Lund研究發(fā)現(xiàn)，菜田的反硝化損失可高達(dá)14%～52%，而N2O排放則占整個反硝化損失的13% ～20%［1］。在這種長期的大水大肥高投入的條件下，整個土體的反硝化特征，比如反硝化潛勢等可能會發(fā)生改變，不同土層之間的反硝化特征也可能會存在差異。

目前對反硝化潛勢等特征的研究多集中在糧田的表層土壤［16-17］，對設(shè)施菜田不同土層土壤研究較少。在設(shè)施菜田中，除了表層土壤進(jìn)行反硝化外，底層土壤也可能會進(jìn)行反硝化，因?yàn)楦咄度氲奶?、氮會淋洗到底層，為反硝化微生物提供底物。忽略對下層土壤的研究可能會低估土壤氮素的反硝化損失。此外，現(xiàn)在對氮素反硝化的研究，多采用田間表層通量研究，很少與剖面觀測同步，這可能會低估反硝化產(chǎn)物量，因?yàn)楸韺油寥莱讼蚩諝庵信欧臢2O和NO等氣體外，還可能同時會向底層土壤擴(kuò)散。

國內(nèi)外研究反硝化過程的方法，多數(shù)是采用乙炔抑制法和示蹤法，這些方法在一定條件下為研究反硝化過程提供了有效途徑，但它們一般不能連續(xù)恒壓檢測，且無法準(zhǔn)確地定量N2，從而很難精確追蹤反硝化過程。本研究采用引進(jìn)的自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng))進(jìn)行相關(guān)研究［18］。該系統(tǒng)可連續(xù)在線實(shí)時恒壓監(jiān)測反硝化過程中N2O、NO、N2、O2和CO2的濃度變化，密封性較好，可準(zhǔn)確定量N2。因此，本研究以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在山東壽光的大棚蔬菜地的長期定位試驗(yàn)點(diǎn)土壤為研究對象，采用原位土壤硅膠管測定法和自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng))研究剖面原位N2O濃度變化和各土層反硝化產(chǎn)物的產(chǎn)生特征，為準(zhǔn)確定量地測定設(shè)施菜田土壤反硝化損失、N2O和NO的排放量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)概況

本試驗(yàn)田是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在山東省壽光市羅家村(36o55'N，118o45'E)的一個長期定位試驗(yàn)點(diǎn)。該試驗(yàn)點(diǎn)建于2004年，每年種植兩季番茄。所選溫室為該地區(qū)典型的傳統(tǒng)冬溫式日光溫室，采用后土墻(3.5 m)，水泥柱和竹架結(jié)構(gòu)，種植土地寬7.8 m，長84 m，種植面積為655 m2，常年覆蓋乙烯–醋酸乙烯(EVA)多功能復(fù)合膜。當(dāng)?shù)氐淖匀荒杲邓繛?58 mm，平均溫度12.4℃。試驗(yàn)初始時，0—10 cm土層土壤有機(jī)質(zhì)含量為18.3 g/kg，全氮1.37 g/kg，-N 112 mg/kg，速效鉀 299 mg/kg，速效磷299 mg/kg，容重1.44 g/cm3。有關(guān)試驗(yàn)點(diǎn)的更多細(xì)節(jié)參考 Ren 等［19］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

試驗(yàn)分為田間原位測定和室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)兩個部分。

1.2.1 田間原位測定 試驗(yàn)從2010年3月21日開始，到2010年5月28日結(jié)束，包括2010年冬春季的所有6次追肥時期。試驗(yàn)處理包括:1)空白對照處理(CK)，不施用有機(jī)肥和化學(xué)氮肥;2)農(nóng)民傳統(tǒng)施肥處理(CN)，即在實(shí)驗(yàn)開始前，施風(fēng)干雞糞8 t/hm2，相當(dāng)于N 146 kg/hm2，均勻撒入作為基肥?；瘜W(xué)氮肥作為追肥和灌溉水一起施用。追肥時間根據(jù)作物的生長發(fā)育情況由農(nóng)戶決定，每次用量為N 120 kg/hm2，共6次，共施 N 720 kg/hm2。6次追肥時間分別為3月26日、4月7日、4月22日、4月30日、5月10日和5月19日，每次灌溉量約為50 mm。小區(qū)面積為7.8 m ×5.6 m，3次重復(fù)。

采用硅膠管法對土壤剖面的N2O濃度進(jìn)行觀測［20］。在每個小區(qū)的50 cm和90 cm處，埋下水平纏繞成圈形的硅膠管，硅膠管的一端封閉，另一端連接Teflon小管。Teflon小管內(nèi)徑2 mm，外徑4 mm，另一端連接三通閥，三通閥露出地表10 cm。硅膠管壁厚3 mm，內(nèi)徑10 mm，長1.3 m，內(nèi)部集氣體積約100 mL。采氣時，用60 mL注射器連接三通閥，抽大約40 mL氣體。采氣后，打開三通閥使它與大氣相通，以便平衡里面氣壓，隨后關(guān)閉。在施肥前采氣一次，施肥后約每隔一天采氣一次。

1.2.2 室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn) 在作物生長季，施肥灌水前(2010年5月9日)，在每個小區(qū)的0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm和80—100 cm處各取200 g土樣，過2 mm篩后，在4℃下儲藏備用。取土樣12 g放入120 mL培養(yǎng)瓶中，加去離子水25 mL，瓶中加有磁力攪拌器，每次攪拌時間為30 s，停頓10 s，以使氣液相平衡。用充氣抽真空清洗系統(tǒng)(帥恩科技，北京)抽真空后，用He氣充滿，反復(fù)沖洗3次。最后培養(yǎng)瓶中的He氣壓約為1.5個大氣壓，然后在瓶塞上插入一個沒有活塞的注射器，里面放有少量水，用來平衡瓶內(nèi)氣壓。隨后放在恒溫18℃的水浴培養(yǎng)，由自動連續(xù)在線培養(yǎng)體系(Robot系統(tǒng)，挪威生命科學(xué)大學(xué)研發(fā))自動進(jìn)樣［18］，測量里面N2O，O2，CO2，NO和 N2等氣體的變化。為了避免的不足，在培養(yǎng)至48 h時，每個培養(yǎng)瓶注入1 mL濃度為140 mmol/L的-N。為監(jiān)測碳源對反硝化過程的影響，培養(yǎng)至184 h時，注入1 mL濃度為87 mmol/L的-N和145 mmol/L的葡萄糖。整個培養(yǎng)時間為330 h，在此期間Robot系統(tǒng)每8 h持續(xù)地記錄 NO、N2O、O2和 N2濃度的變化情況。

1.3 樣品采集和測定

1.3.1 氣樣的采集和測定 田間試驗(yàn)氣體采樣后，在24h內(nèi)上氣相色譜測量N2O濃度。該氣譜采用裝有微池電子捕獲檢測器(HP 6890 Miceo-ECD)的美國產(chǎn)Agilent 6890氣相色譜儀，柱溫為55℃，檢測器溫度330℃。載氣為純度99.999%的高純氮?dú)?，流?5 mL/min。

室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)的 N2O、O2、CO2、NO和 N2等氣體的變化由Robot自動培養(yǎng)系統(tǒng)測定。自動培養(yǎng)系統(tǒng)包括自動進(jìn)樣模塊和氣體分析模塊。自動進(jìn)樣模塊包括頂空自動采樣器(CTC GC-Pal)和雙向旋轉(zhuǎn)的蠕動泵(Gilson Minipuls 3)組成。氣體分析模塊由氣相色譜儀(Agilent GC 7890A，美國)和氮氧化物分析儀(TAPI Model 200E)組成，其中氣相色譜內(nèi)安裝有3個檢測器(ECD、TCD、FID)和4根分離柱(填充柱和毛細(xì)柱各2根)，能夠分離和測定N2O(ECD)、N2(TCD)、O2(TCD)和 CO2(TCD)。

1.3.2 其他參數(shù)的測定 培養(yǎng)前后，用0.1 mol/L的KCl進(jìn)行浸提，用連續(xù)流動分析儀(TRACCS2000，德國產(chǎn))測定各層土壤樣品中和的含量。采用碳、氮分析儀(vario MACRO CN)測定不同土層土壤中的有機(jī)碳和全氮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 追肥后剖面原位N2O濃度的變化特征

圖1 追肥后設(shè)施菜田土壤剖面50 cm處N2O的變化Fig.1 The N2O dynamics at 50 cm soil depth in the greenhouse vegetable cropping system after the side-dressing

追肥后設(shè)施菜田剖面N2O濃度的變化特征見圖1和圖2。由圖1和2可見，每次灌溉追肥后，CN處理剖面原位50 cm處和90 cm處的N2O的濃度都會出現(xiàn)一個濃度峰值，且每次50 cm處的N2O濃度的峰值都高于90 cm處。CN處理剖面50 cm處的N2O 變化在 2.15 ～50.77 μL/L 之間，平均為 9.92 μL/L。相對于50 cm處，CN處理剖面90 cm處的N2O 濃度變化幅度較小，在 2.57 ～14.05 μL/L 之間，平均為5.64 μL/L。與CN處理相比，CK處理的剖面原位N2O濃度卻幾乎不受灌溉的影響，50 cm處和90 cm處的N2O濃度的變幅較小，在1.43～2.75 μL/L 之間。

圖2 追肥后設(shè)施菜田土壤剖面90 cm處N2O的變化Fig.2 The N2O dynamics at 90 cm soil depth in the greenhouse vegetable cropping system after the side-dressing

2.2 不同土層N2O產(chǎn)生的潛勢

從圖3可以看出，不同土層產(chǎn)生N2O的潛勢不同，在開始的48 h內(nèi)，CK和CN處理0—20 cm土層產(chǎn)生的N2O的量均迅速增加，但CK處理產(chǎn)生的N2O排放峰值遠(yuǎn)低于CN處理。CK處理產(chǎn)生的N2O峰值為N2O 20.6 nmol/g土，而CN處理產(chǎn)生N2O量的峰值則高達(dá) 315.0 nmol/g土(圖 3 a)。20—40 cm土層，從開始到添加葡萄糖前，CN處理的N2O產(chǎn)生量一直增加，但增加速度并沒有0—20 cm土層快，而CK處理N2O的產(chǎn)生量變化卻較小(圖3 b)。在開始的48 h內(nèi)，40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm三個土層，CK和CN處理的N2O產(chǎn)生量都較小(圖3 c，d，e)，添加KNO3后，這三個土層的N2O的產(chǎn)生量并沒有較大改變。

在184 h注入硝酸鉀和葡萄糖后，CN處理的0—20 cm和20—40 cm土層土壤并沒有產(chǎn)生N2O，甚至開始消耗N2O(圖3 a，b)，這與在反硝化活性較強(qiáng)的土壤中，增加碳源將促進(jìn)N2O還原有關(guān)［21］。而40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm的土壤兩個處理卻都開始產(chǎn)生N2O，并和CN處理20—40 cm土層土壤類似，在264 h左右出現(xiàn)一個小的排放峰值，與反硝化過程較強(qiáng)烈有關(guān)(圖4)。

2.3 不同土層的反硝化潛勢

從圖4可以看出，不同土層土壤的反硝化潛勢有很大差別。在培養(yǎng)開始的48 h內(nèi)，CK和CN處理的0—20 cm土層土壤的反硝化產(chǎn)物不斷的增加，其中CN處理高于CK處理的(圖4 a)。其他各層CK和CN處理的反硝化產(chǎn)物均較少(圖4 b，c，d，e)。在加入充足的后，兩個處理的0—20 cm土層的反硝化產(chǎn)物仍然不斷增加，且遠(yuǎn)高于其他各層。兩個處理在20—40 cm土層的反硝化產(chǎn)物也有不斷增加的趨勢，但增加趨勢相對0—20 cm土層較慢(圖4 a，b)。在添加的條件下，40—60 cm，60—80 cm，80—100 cm的反硝化產(chǎn)物的量卻幾乎沒有增加(圖4 c，d，e)，這說明土壤反硝化過程主要發(fā)生在0—20 cm和20—40 cm土層。184 h時，隨著碳源葡萄糖的加入，CK和CN兩個處理0—20 cm土層土壤的反硝化產(chǎn)物迅速地增加，其中CN處理增幅比CK大，產(chǎn)生的氮(N)從184 h的5045.4 nmol/g，增加到 264 h 的 28006.1 nmol/g，增加了近6倍。而其他各層的兩個處理，在添加碳源后反硝化產(chǎn)物卻沒有立即迅速增加，而是經(jīng)過約48 h的滯后期后，即在232 h時開始迅速的增加，直到達(dá)到穩(wěn)定的N2濃度平臺。

2.4不同土層土壤性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化

由表1結(jié)果看出，在0—20和20—40 cm土層土壤中，CN處理的有機(jī)碳和有機(jī)氮顯著高于CK處理，40—60 cm，60—80 cm 和80—100 cm 的土層土壤中，CN和CK處理之間沒有顯著性差異。此外，在相同處理?xiàng)l件下，上層(0—40 cm)土壤的機(jī)碳和有機(jī)氮含量顯著高于底層(60—100 cm)土壤。

2.5 不同土層NO產(chǎn)生的潛勢

反硝化過程中，土壤除了會產(chǎn)生N2O和N2等氣體外，還會產(chǎn)生NO。從圖5可以看出，在開始的16 h內(nèi)，CK和CN處理0—20 cm土層產(chǎn)生NO的量都迅速增加，但CN處理產(chǎn)生的NO量遠(yuǎn)高于CK處理。CN處理產(chǎn)生的NO峰值為每克土產(chǎn)生12.6 nmol的NO，而CK處理產(chǎn)生的峰值則為每克土4.2 nmol的NO(圖5 a)。在20—40 cm土層，從開始到添加葡萄糖前，CN處理的NO產(chǎn)生量一直增加，而CK處理的NO濃度卻變化較小(圖5 b)。從開始到添加KNO3，40—60 cm，60—80 cm和80—100 cm 三個土層，CK和CN處理的NO的產(chǎn)生量均較小(圖5 c，d，e)。當(dāng)加入碳源后，各土層都會出現(xiàn)一個短暫的NO的排放小峰，這與反硝化過程的強(qiáng)烈進(jìn)行有關(guān)(圖4)。

3 討論

設(shè)施菜田土壤剖面N2O的濃度高出糧田的幾十倍［23］，這主要和設(shè)施菜田碳、氮和水的高投入有關(guān)。與傳統(tǒng)的施肥處理相比，不施肥的對照處理土壤剖面N2O濃度較低，且?guī)缀醪皇芄嗨挠绊?，說明碳、氮的投入為反硝化過程提供了底物，在此基礎(chǔ)上，灌水會增加嫌氣區(qū)域，促進(jìn)反硝化過程的進(jìn)行。但如果土壤中缺少底物碳和氮，即使在灌水厭氧條件下，反硝化過程進(jìn)行的也相對較弱。

反硝化和N2O產(chǎn)生能力較強(qiáng)的均是上層(0—40 cm)土壤，而40—100 cm的底層土壤受碳源限制，反硝化較難進(jìn)行，不太可能產(chǎn)生高濃度的N2O。田間檢測到的底層土壤的高濃度N2O可能是來源于表層土壤N2O的擴(kuò)散，本研究結(jié)果中，50 cm處N2O濃度遠(yuǎn)高于90 cm也支持了這一推測，說明通常的田間表層通量觀測會低估N2O的排放量。而這些高濃度的N2O，最終是長期滯留在土壤底層還是會被上層土壤再次還原成N2，還需要進(jìn)一步的研究。

與范曉暉和朱兆良對三種農(nóng)田土壤的研究結(jié)果類似，設(shè)施菜田反硝化也主要發(fā)生在表層，因?yàn)楸韺拥耐寥烙袡C(jī)碳較高，為反硝化微生物提供了能源［24］。底層土壤的微生物可利用的有機(jī)碳較少，反硝化活性一般較弱。但加入碳源后，其反硝化潛勢在經(jīng)過一個滯后時期后迅速增加，并達(dá)到與表層土壤產(chǎn)生的反硝化潛勢相當(dāng)?shù)某潭?。這說明當(dāng)有足夠的碳源時，反硝化微生物活性會迅速增強(qiáng)。在田間條件下，有機(jī)碳和硝酸鹽的向下移動，可能會促進(jìn)底層土壤反硝化的進(jìn)行，但目前人們通常取表土來定量反硝化損失［25-26］。在大田條件下，由于有機(jī)肥施用量較低，灌水次數(shù)較少，下層土壤的反硝化損失或許可以忽略。然而在設(shè)施菜田中，化肥和有機(jī)肥的大量投入以及頻繁的灌水［27-28］，將為底層土壤提供一定的碳源和硝酸鹽，對反硝化有促進(jìn)作用。不考慮這部分土壤的反硝化損失，有可能低估氮素氣態(tài)損失量。

綜上所述，在田間條件下，雖然設(shè)施菜田土壤反硝化過程主要發(fā)生在表層，但是施肥和灌溉后，N2O有向剖面下部遷移的趨勢，田間的通量觀測有可能低估N2O的產(chǎn)生量。同時，底層土壤也有一定的反硝化潛勢，在定量研究土壤氮素的反硝化損失時，應(yīng)當(dāng)予以考慮。

表1不同土層土壤的性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化Table 1 Soil characteristics，measured N －species at the start and end of the incubation in different soil layers

表1不同土層土壤的性狀及培養(yǎng)前后-N和-N的變化Table 1 Soil characteristics，measured N －species at the start and end of the incubation in different soil layers

注(Note):*表示相同土層CK和CN處理之間的差異顯著(P＜0.05)Significant difference for CK and CN treatments in the same soil layers(P＜0.05);不同字母表示相同施肥處理不同土層差異顯著(P＜0.05)The different letters in the same treatment mean significant difference for different soil layers(P ＜0.05).

處理Treatment土層Layer(cm)有機(jī)碳Organic C(g/kg)有機(jī)氮Organic N(g/kg)培養(yǎng)前Start NH+4-N(mg/kg)培養(yǎng)前Start NO-3-N(mg/kg)培養(yǎng)后End NH+4-N(mg/kg)培養(yǎng)后End NO-3-N(mg/kg)CK 0—20 8.9 ±0.5 a 1.2 ±0.0 a 6.1 ±0.3 a 22.3 ±1.3 a 31.9±3.1 a 0.7 ±0.4 a 20—40 4.3 ±0.2 b 0.6 ±0.0 b 2.5 ±0.5 c 4.2 ±1.5 b 30.7 ±2.3 a 0.9 ±1.0 a 40—60 3.7 ±0.4 bc 0.6 ±0.0 b 5.8 ±0.3 a 6.0 ±3.0 b 27.0 ±0.7 a 1.0 ±0.8 a 60—80 2.9 ±0.2 cd 0.4 ±0.0 cd 5.3 ±1.2 ab 6.3 ±0.7 b 9.6 ±3.1 b 1.5 ±0.7 a 80—100 2.2 ±0.3 d 0.4 ±0.0 d 3.4 ±0.5 bc 5.2 ±1.5 b 12.0 ±2.5 b 0.9 ±0.6 a CN 0—20 12.2 ±0.3*a 1.7 ±0.1*a 5.7 ±0.9 a 107.0 ±15.5*a 44.0 ±2.8 a 1.0 ±0.7 a 20—40 6.3 ±1.1*b 0.9 ±0.1*bc 2.7 ±0.7 b 47.2 ±7.4*b 31.6 ±12.2 ab 0.9 ±0.7 a 40—60 4.9 ±0.5 bcd 0.7 ±0.1 cd 5.0 ±0.9 a 36.5 ±4.2*b 31.2 ±2.5 ab 0.8 ±0.7 a 60—80 3.5 ±0.3 cd 0.5 ±0.0 d 4.7 ±1.2 a 31.5 ±5.5*b 25.5 ±0.2*bc 0.7 ±0.2 a 80—100 2.9 ±1.1 d 0.5 ±0.1 d 4.1 ±0.3 a 36.3 ±3.8*b 13.3 ±3.5 c 0.4 ±0.6 a

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