nHA／PCL復(fù)合材料組分配比對(duì)成骨細(xì)胞骨相關(guān)基因表達(dá)的影響研究

唐俊龍，王朝元，劉 介

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074）

1 引言

骨包括有機(jī)相（非膠原蛋白和膠原）和無(wú)機(jī)相，羥基磷灰石（HA）是骨無(wú)機(jī)相的主要成分，約占干骨組織的45%。用HA來(lái)做骨植入材料不僅生物相容性高、機(jī)械性能好、化學(xué)性能穩(wěn)定，還能明顯的促進(jìn)骨的生長(zhǎng)，故長(zhǎng)期以來(lái)作為生物活性材料。但純HA因脆性大、抗疲勞性強(qiáng)度不高、難以降解［1］等缺點(diǎn)限制了臨床應(yīng)用。聚已內(nèi)酯（PCL）是線性的脂肪聚酯，具有良好的生物降解性和相容性［2］，但其強(qiáng)度低難以滿足骨植入材料的要求。因此，我們制成納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯（nHA／PCL）復(fù)合材料，它結(jié)合了兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物相容性并能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［3］，有望成為一種具有臨床前景的新穎骨替換材料。李家峰，萬(wàn)美蓉［4］等的研究顯示人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)nHA／PCL過(guò)納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯復(fù)合物誘導(dǎo)后其骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)上調(diào)。說(shuō)明HA的加入可以提高惰性材料的生物活性，nHA／PCL可以預(yù)期，納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯復(fù)合物具有良好的體內(nèi)成骨作用。

本文集中探討不同配比納米羥基磷灰石／聚已內(nèi)酯（nHA∶PCL＝0∶100、nHA∶PCL1＝40∶60、nHA∶PCL2＝60∶40）對(duì)成骨細(xì)胞骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，能從分子水平了解HA在復(fù)合材料中的作用和影響成骨細(xì)胞的分子機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

nHA／PCL復(fù)合材料（華東理工大學(xué)生物材料研究所），小鼠成骨細(xì)胞株（MC3T3－E1，上海細(xì)胞生物研究所），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），新生牛血清（杭州四季清）、青霉素（BIOSHARP）、鏈霉素（BIOSHARP），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），胰蛋白酶（Amresco），二甲基亞砜（Amresco），ALP試劑盒（南京建成生物科技公司），Trizol（Invitrogen），PCR 引物（武漢 博越 技術(shù) 有限 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）。CO2培養(yǎng)箱（HF90／240型，利康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)），倒置顯微鏡（Motic AE21型，重慶光學(xué)儀器），普通PCR儀（Biometra，德國(guó)），凝膠成像分析儀 （JS－380A，上海培清科技）。

2.2 原代小鼠顱骨成骨細(xì)胞（PMO）培養(yǎng)

將新生昆明種小鼠頭顱剪碎，0.25%胰酶消化后，加入5mL培養(yǎng)基（含10%新生牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素），1500r／min離心5min沉淀細(xì)胞，棄上清，加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2飽和度條件下培養(yǎng)。

2.3 nHA／PCL復(fù)合材料的制備

nHA和PCL按0∶100；40∶60；60∶40不同比例混勻，PCL在15MPa壓力下3min形成片狀。用砂紙打磨材料片表面并漂洗干凈，濕熱滅菌后備用。

2.4 不同配比nHA／PCL復(fù)合物對(duì)骨相關(guān)基因表達(dá)

將細(xì)胞以2×105個(gè)／cm2濃度接種于培養(yǎng)皿中的nHA／PCL片上，并以同樣濃度的細(xì)胞接種于普通玻璃培養(yǎng)瓶中作為空白對(duì)照。靜置2h，讓細(xì)胞貼壁。每皿加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基將材料片浸沒(méi)，置培養(yǎng)皿于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4d換1次培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)2、6、12d的細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成為cDNA，以cDNA為模板，用骨相關(guān)基因引物（表1）進(jìn)行普通PCR。PCR反應(yīng)條件：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，68℃，90s，30個(gè)循環(huán)；68℃，5min。以 GAPDH 為內(nèi)參基因，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定骨相關(guān)基因的表達(dá)差異。用SensiAnsys軟件對(duì)目標(biāo)基因與GAPDH灰度比來(lái)計(jì)算表達(dá)量。

表1 骨相關(guān)基因PCR擴(kuò)增的引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 不同材料對(duì)骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.1.1 不同材料對(duì)成骨細(xì)胞OP基因表達(dá)的影響

不同材料片對(duì)成骨細(xì)胞OP基因mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，經(jīng)2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細(xì)胞的上生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞的OP基因表達(dá)量高于對(duì)照和PCL材料片上的OP基因表達(dá)量或者接近，而PCL材料片上生長(zhǎng)的細(xì)胞OP基因表達(dá)量要低于對(duì)照組（圖1a）。在 MC3T3－E1細(xì)胞的OP基因系中也有相同趨勢(shì)（圖1b）。

圖1 nHA／PCL and PCL對(duì)PMO和MC3T3－E1細(xì)胞OP表達(dá)的影響

3.1.2 不同材料對(duì)成骨細(xì)胞ON基因表達(dá)的影響

不同材料片對(duì)成骨細(xì)胞ON基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細(xì)胞ON基因表達(dá)量均高于對(duì)照和PCL材料片上的ON基因表達(dá)量，而PCL材料片上生長(zhǎng)的細(xì)胞ON基因表達(dá)量要低于對(duì)照組（圖2a）。在MC3T3－E1細(xì)胞的ON基因系中也有相同也出現(xiàn)了相似的趨勢(shì)（圖2b）。

圖2 nHA／PCL and PCL對(duì)PMO和MC3T3－E1細(xì)胞ON表達(dá)的影響

3.1.3 不同材料對(duì)成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)的影響

不同材料片對(duì)成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。經(jīng)2、6、12d，OC基因的表達(dá)變化不大。2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞的OC基因表達(dá)量高于對(duì)照和PCL材料片上的成骨細(xì)胞OC基因表達(dá)量。PCL材料片上生長(zhǎng)的細(xì)胞OC基因表達(dá)量要低于或近似于對(duì)照組。

圖3 nHA／PCL and PCL對(duì)PMO和MC3T3－E1細(xì)胞OC表達(dá)的影響

3.1.4 不同材料對(duì)成骨細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響

不同材料對(duì)成骨細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，經(jīng)2、6、12d，ALP基因的表達(dá)量逐步降低。12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長(zhǎng)的細(xì)胞的ALP基因表達(dá)量比對(duì)照的ALP基因表達(dá)量要低于或近似于對(duì)照組。

圖4 nHA／PCL and PCL對(duì)PMO和MC3T3－E1細(xì)胞ALP基因表達(dá)的影響

4 結(jié)語(yǔ)

本文以成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系（MC3T3－E1）和原代小鼠成骨細(xì)胞（PMO）這兩種成骨細(xì)胞作為材料研究的模式細(xì)胞，前者具有成骨細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，包括堿性磷酸酶活性、Ⅰ－型膠原合成和基質(zhì)礦化等；后者則更接近體內(nèi)細(xì)胞活性，以此對(duì)比相同材料對(duì)不同成骨細(xì)胞的影響差異。

成骨細(xì)胞在骨形成過(guò)程中經(jīng)歷分裂增殖、分化成熟和基質(zhì)鈣化3個(gè)階段［5］。其中堿性磷酸酶（ALP）是一種膜結(jié)合蛋白，可水解有機(jī)磷酸酯為基質(zhì)提供足夠的磷酸濃度使鈣鹽沉積于基質(zhì)上，它在分化早期大量表達(dá)，在骨基質(zhì)成熟過(guò)程中起重要作用，是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。骨鈣素（OC）是由成骨細(xì)胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，它是構(gòu)成成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)成分之一，能維持礦化速度，抑制異常羥基磷灰石的形成。骨連蛋白（ON）能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間的相互作用。骨橋蛋白（OPN）廣泛分布于多種組織和細(xì)胞，是一種非膠原骨基質(zhì)糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化等過(guò)程。這些蛋白在成骨細(xì)胞分化成熟和基質(zhì)鈣化過(guò)程中均有重要作用，其對(duì)應(yīng)的基因統(tǒng)稱(chēng)為骨相關(guān)基因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：nHA／PCL1、nHA／PCL2在一定程度上促進(jìn)了OC、ON、OPN的表達(dá)，而對(duì)ALP的表達(dá)有較低的抑制作用，在MC3T3－E1和PMO細(xì)胞上表現(xiàn)無(wú)差別。說(shuō)明nHA／PCL復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性和促成骨細(xì)胞活性，在惰性材料中加入一定比例的HA等材料，可提高材料的生物活性，與前人研究結(jié)果［5］一致。以此材料為基礎(chǔ)，可進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)出新型的具有臨床應(yīng)用前景的骨修復(fù)材料。

［1］唐文勝，蔣電明.羥基磷灰石及其復(fù)合材料在骨修復(fù)中的作用及研究進(jìn)展［J］.中華創(chuàng)傷骨科雜志，2003，5（4）：370～373.

［2］Causa F，Netti P A，Ambrosio L，et al.Poly－epsiloncaprolactone／hydroxyapatite composites for bone regeneration：in vitro characterization and human osteoblast response［J］.J Biomed Mater Res A，2006（76）：51～62.

［3］王朝元，李 俊，劉 介.nHA／PCL復(fù)合材料對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響［J］.中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，30（2）：51～53.

［4］李家鋒，萬(wàn)美蓉，管海虹，等.不同配比納米羥基磷灰石／聚己內(nèi)酯復(fù)合材料細(xì)胞相容性的研究［J］.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2011，20（2）：243～246.

［5］Owen T A，Aronow M，Shalhoub V，et al Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro：reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extra cellular matrix［J］.J Cell Physio，11990，143（3）：420.

［6］葉 玲，蘇 勤，周學(xué)東.納米羥磷灰石／聚酰胺66對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23（2）：142～144.

［7］蘇佳燦，李 明，禹寶慶，等.納米羥基磷灰石／聚己內(nèi)酯復(fù)合生物活性多孑L支架研究［J］.無(wú)機(jī)材料學(xué)報(bào).2009，24（3）：485～490.

［8］陳建海，黃春霞，陳志良.聚已內(nèi)酯材料的生物相容性于毒理學(xué)研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志.2000，17（4）：380～382.

［9］Hsw F Y，Chueh S C，Wang Y J.Microshperes of hydroxyapatite／reconstitutend collagc as supports for osteoblast cell growth［J］.Biomaterials，1999（20）：1931～1936.

［10］Wang X J，Li Y B.Development of biomineticnano－h(huán)ydroxyapatite／poly（hexamethylethyleneadipamide）composites［J］.Biomaterials，2002（23）：4787～4791.

［12］Rohner D，Hutmaeher DW，See P，et al.Individually CAD 一CAM technique designedbioresorbable 3－dimensional Polycaprolactone frame work for experimental reconstruction of craniofacial defeets in the pig［J］.M KG，2002，6（3）：162～167

［13］Jayarama Reddy Venugopal，Sharon Low，Aw Tar Choon.Nanobioengineered Electrospun Composite Nanofibers and Osteoblasts for Bone Regenera［J］.Artif Organs，2008，32（5）：388～397.