南瓜花葉病毒膠體金免疫層析試紙條的研制

梁新苗， 邊 勇， 鄧叢良， 李桂芬， 周 琦， 汪萬(wàn)春

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 101312；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所，北京 100029）

南瓜花葉病毒膠體金免疫層析試紙條的研制

梁新苗1＊， 邊 勇1， 鄧叢良1， 李桂芬2， 周 琦1， 汪萬(wàn)春1

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 101312；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫研究所，北京 100029）

使用檸檬酸三鈉還原法制備25nm粒徑的膠體金顆粒，在pH7.6，蛋白用量13μg／mL條件下，制備形成穩(wěn)定膠體金蛋白復(fù)合物；使用微定量噴頭在硝酸纖維素膜上噴好病毒檢測(cè)線和質(zhì)控線，組裝制成免疫層析檢測(cè)試紙條。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后制備的南瓜花葉病毒試紙條特異性好，可在10min內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果，且對(duì)南瓜花葉病毒陽(yáng)性材料的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到稀釋104倍。

南瓜花葉病毒； 膠體金免疫層析； 檢測(cè)試紙條

南瓜花葉病毒（Squashmosaicvirus，SqMV）為豇豆花葉病毒屬（Comovirus）成員，主要危害黃瓜、甜瓜、西葫蘆、哈密瓜等葫蘆科植物，受侵染的植物出現(xiàn)環(huán)斑，嚴(yán)重的出現(xiàn)水泡狀斑點(diǎn)，有的出現(xiàn)葉綠素分布不均，葉面出現(xiàn)黃斑或深淺相間斑駁花葉，有時(shí)沿葉脈葉綠素濃度增高，形成深綠色相間帶，嚴(yán)重的致葉面呈現(xiàn)凹凸不平，脈皺曲變形。病情嚴(yán)重時(shí)，莖蔓和頂葉扭縮，果實(shí)染病出現(xiàn)褪綠斑。開(kāi)花結(jié)果后病情趨于加重，影響寄主植物品質(zhì)及產(chǎn)量。該病毒可通過(guò)種子、汁液接觸傳播和昆蟲(chóng)介體傳播。在對(duì)該病毒的防治過(guò)程中，既需要進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，又需要田間快速診斷。本文以此為出發(fā)點(diǎn)，利用膠體金免疫層析技術(shù)［1］，制備了具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等特點(diǎn)的南瓜花葉病毒檢測(cè)試紙條，以適應(yīng)基層工作的實(shí)際需求。

1 材料與方法

1.1 病毒來(lái)源

由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所提供。

1.2 病毒繁殖

1g病毒陽(yáng)性材料加入適量接種緩沖液后，在研缽中磨碎，取研磨液，于西葫蘆幼苗的兩片子葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行摩擦接種，接種完畢后用蒸餾水沖洗。待出現(xiàn)明顯危害癥狀后，取顯癥狀葉片備用。

1.3 病毒抗體制備

用純化病毒制劑免疫家兔，共免疫4次，每次0.25mg病毒，后腿肌肉注射。第1次免疫用弗氏完全佐劑乳化，第2、3、4次免疫用弗氏不完全佐劑乳化。每次免疫間隔一周。第4次免疫后一周耳靜脈采血測(cè)效價(jià)［2］。

1.4 膠體金的制備［3－6］

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，參考魏梅生等［3］的方法，步驟如下：

（1）取0.01%氯金酸溶液100mL加熱煮沸；

（2）37℃預(yù)溫1%檸檬酸鈉，取1.5mL，快速一次加入氯金酸溶液中，溶液由藍(lán)逐漸變?yōu)榧t色，煮沸3～5min；

（3）冷卻后，用0.22μm濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）在530nm下測(cè)定吸光值，檢測(cè)膠體金制備質(zhì)量，吸光值應(yīng)在0.8～1.2之間。

（5）或進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問(wèn)題，須重新制備。

1.5 金標(biāo)抗體的條件優(yōu)化及制備［7－8］

1.5.1 最適pH的確定

采用倪同浩等［7］報(bào)道的方法，具體如下：

（1）取若干個(gè)1.5mL試管，分別加入1mL所制備的膠體金；

（2）用0.1mol／L K2CO3分別添加10μL，20μL……100μL；

（3）取一96孔培養(yǎng)板，按pH從低到高分別將上述膠體金取100μL加入孔中，重復(fù)3次；

（4）每孔分別加入3μL濃度為1mg／mL的抗體，混合，室溫下放置10～15min；

（5）每孔分別加入20μL濃度為10%NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；

（6）觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH；

（7）觀察膠體金顏色變化直到室溫下放置2h，記錄仍保持紅色的最低pH。

（8）以最低pH增加0.5為最適pH。

1.5.2 膠體金與抗體配比量的確定

（1）用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾或高速離心去除蛋白中殘物或多聚體；

（2）取一96孔滴定板，每個(gè)重復(fù)為若干個(gè)孔，分別加入最佳pH的膠體金100μL，重復(fù)3次；

（3）各孔依次加入不同量的蛋白（濃度為0.1mg／mL）1～20μL，混勻，室溫下放置15min；

（4）加入20μL 10%NaCl，室溫下放置10min；

（5）顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即最小蛋白濃度；

（6）為確保結(jié)果準(zhǔn)確性，可放大反應(yīng)體積重復(fù)以上步驟；

（7）確定最小濃度后，按照最小濃度的130%為最佳濃度。

1.5.3 金標(biāo)抗體的制備

（1）取50mL所制備的膠體金；

（2）加入適量25mmol／L K2CO3調(diào)整pH 至最適濃度；

（3）加入最適濃度的抗體，混勻，室溫放置10min；

（4）加入10%聚乙二醇（PEG20000）1mL（終濃度為0.2%），室溫放置5min；

（5）14 000r／min離心20min，小心吸除上清；

（6）沉淀溶于5mL保存液，加5mL稀釋液溶解為絮狀物；

（7）4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測(cè)試紙條的制作

1.6.1 金標(biāo)墊的制備

取3mL膠體金一抗體結(jié)合物，加3mL稀釋液混勻。放入玻璃纖維素紙浸泡10min，取出置37℃烤箱中烤干，熱合封口，置4℃冰箱備用。

1.6.2 NC膜的制備

（1）將病毒抗體和羊抗兔抗體用固相緩沖液分別稀釋，終濃度為2mg／mL和2.5mg／mL；

（2）在三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，將兩種抗體均勻地平行噴在硝酸纖維素膜上，分別為T線和C線，兩線間隔5mm；

（3）室溫條件下自然風(fēng)干；

（4）在0.1%BSA封閉液中封閉1h；

（5）將NC膜在洗滌液中洗滌2次，每次5min；

（6）室溫條件下自然風(fēng)干。

1.6.3 試紙條的組裝

（1）在雙面膠塑料板中央黏附抗體固相硝酸纖維素膜；

（2）在雙面膠塑料板T線一側(cè)黏附金標(biāo)抗體結(jié)合物玻璃纖維素紙條帶，并與抗體固相膜重合2mm，再粘貼一層膠帶；

（3）同樣在C線一側(cè)黏附吸水紙，也與抗體固相膜重合2mm，粘貼一層膠帶；

（4）用BioDotCM4000切條機(jī)切成4mm寬的試紙條。

1.7 試紙條的檢測(cè)方法

將有膠體金復(fù)合物的一端插入離心后的檢測(cè)樣品液中，10min左右判斷結(jié)果。若試紙條僅質(zhì)控C線出現(xiàn)紫紅色線而檢測(cè)T線未顯色，結(jié)果為陰性；若試紙條上C線和T線均出現(xiàn)紫紅色，結(jié)果為陽(yáng)性；若試紙條C線和T線都沒(méi)有顯色，則說(shuō)明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無(wú)效。

1.8 試紙條的質(zhì)量檢測(cè)

1.8.1 特異性試驗(yàn)

分別取攜帶南瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃花葉病毒的發(fā)病葉片按1∶10（W／V）加入PBS緩沖液，用研缽研磨成漿，2 000r／min離心10min，上清即為制備好的檢測(cè)樣品。將金標(biāo)試紙條插入上述溶液中，取出后觀察，按照1.7的方法進(jìn)行判斷。每種病毒3個(gè)重復(fù)。

1.8.2 靈敏度試驗(yàn)

取檢測(cè)樣品，分別稀釋101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，進(jìn)行靈敏度比較，測(cè)試方法同1.8.1。

1.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將包被抗原抗體的免疫膠體金層析條用塑料袋密封，加入干燥劑，分別置于4、37℃、室溫（20～25℃）條件下，其中置于4℃和室溫條件的試紙條每隔7d取出3條，置于37℃的每天取出3條，分別檢測(cè)陰性樣本和陽(yáng)性樣本。觀察檢測(cè)線的有無(wú)、顏色深淺及玻璃纖維素膜上金標(biāo)抗體的釋放程度。4℃和室溫條件下的保存試驗(yàn)持續(xù)4周，37℃條件下保存試驗(yàn)持續(xù)7d。

2 結(jié)果

2.1 最適pH

在96孔板上依次加入NaCl后，在1號(hào)～4號(hào)孔為淺藍(lán)色，5號(hào)、6號(hào)孔為過(guò)渡色，7號(hào)～9號(hào)孔為紅色，因此最低pH為7號(hào)管，使用精密試紙測(cè)量其pH為7.1，因此最適pH為7.6。見(jiàn)圖1。

圖1 最適pH測(cè)試

2.2 膠體金與抗體配比量

由于膠體金為帶負(fù)電的疏水性顆粒，在未結(jié)合蛋白或結(jié)合不足時(shí)，加入NaCl后，由于鹽離子效應(yīng)，使膠體金顆粒的性質(zhì)發(fā)生變化，從而出現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象。因此可以通過(guò)加入不同量的抗體蛋白，來(lái)確定最小抗體配比量，進(jìn)而確定最適抗體用量。結(jié)果如圖2，在96孔板上按照不同抗體用量進(jìn)行比較后，在1號(hào)～5號(hào)孔為淺藍(lán)色，6號(hào)、7號(hào)孔為過(guò)渡色，8號(hào)～9號(hào)孔為紅色，因此膠體金與抗體的最適配比為8號(hào)管，即當(dāng)每1mL膠體金溶液中抗體量等于或大于10μg／mL時(shí)，膠體金抗體蛋白結(jié)合物的光密度值不再發(fā)生較大的變化，趨于平穩(wěn)，說(shuō)明膠體金顆粒對(duì)抗體蛋白的吸附基本達(dá)到飽和，因此最適抗體用量為13μg／mL。

2.3 試紙條特異性

經(jīng)過(guò)與南瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃花葉病毒的陽(yáng)性材料測(cè)試比較，僅南瓜花葉病毒陽(yáng)性材料檢測(cè)線及質(zhì)控線均出現(xiàn)明顯條帶，其他陽(yáng)性材料僅質(zhì)控線出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線未出現(xiàn)條帶，因此本試紙條具有特異性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 最適抗體用量測(cè)試

圖3 試紙?zhí)禺愋詼y(cè)試結(jié)果

2.4 試紙條靈敏度

分別稀釋101倍、102倍、103倍、104倍、105倍等不同稀釋倍數(shù)，由圖4可見(jiàn)在陽(yáng)性材料稀釋104倍后檢測(cè)線亦有較明顯條帶，稀釋105倍后檢測(cè)線條帶不明顯，因此本試紙條的檢測(cè)靈敏度為陽(yáng)性材料稀釋104倍。

圖4 試紙靈敏度測(cè)試結(jié)果

2.5 試紙條穩(wěn)定性

從試紙條的測(cè)試結(jié)果來(lái)看，將試紙條放在內(nèi)放干燥劑的封口塑料袋中，室溫和37℃下保存長(zhǎng)時(shí)間后顏色略減弱，其他不同溫度、不同時(shí)間的測(cè)試結(jié)果無(wú)明顯變化，說(shuō)明在適當(dāng)條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

由于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法程序較為復(fù)雜，分析費(fèi)用較高且耗時(shí)等因素，并不適宜大田病害檢測(cè)時(shí)的普遍應(yīng)用，如何建立植物病害簡(jiǎn)便、快速、靈敏，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法，是植物病害檢測(cè)工作發(fā)展的方向。本試驗(yàn)的目的是建立南瓜花葉病毒膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)的方法，使用自制的高特異性金標(biāo)抗體，通過(guò)對(duì)試紙條的條件優(yōu)化，制作出南瓜花葉病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。該檢測(cè)方法最大的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需借助檢測(cè)儀器，檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，10～15min內(nèi)即可檢測(cè)出結(jié)果，且具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。作為一種快速篩查的手段，既可節(jié)省檢測(cè)成本，又可用于廣大基層單位開(kāi)展南瓜花葉病毒的檢測(cè)和防控工作中，具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。

［1］汪琳，周琦，賴平安，等.免疫膠體金技術(shù)及其在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14（4）：56－58.

［2］祁偉，韋傳寶，杜宇.小西葫蘆黃花葉病毒外殼蛋白抗體制備［J］.生物學(xué)雜志，2010，27（1）：35－38.

［3］魏梅生，李桂芬，張周軍，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)煙草環(huán)斑病毒［J］.植物檢疫，2002，16（2）：82－83.

［4］魏梅生，劉洪義，李桂芬.馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒膠體金免疫層析試紙條的研制［J］.植物保護(hù)，2006，32（6）：139－141.

［5］魏梅生，楊翠云，李桂芬.番茄環(huán)斑病毒和煙草環(huán)斑病毒復(fù)合型膠體金免疫層析試紙條的研制［J］.植物檢疫，2008，22（2）：75－77.

［6］孫艷秋，趙奎華，曹遠(yuǎn)銀，等.黃瓜細(xì)菌性角斑病免疫膠體金檢測(cè)試紙條的研制［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（2）：131－138.

［7］倪同浩.鏈霉素膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條的研制［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009.

［8］張曉雷.四種檢疫性植物病毒的膠體金免疫層析試紙條的研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

Gold immunochromatography assay for rapid detection ofSquashmosaicvirus

Liang Xinmiao1， Bian Yong1， Deng Congliang1， Li Guifen2， Zhou Qi1， Wang Wanchun1
（1.BeijingEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Beijing101312，China；2.InstituteofAnimalandPlantQuarantine，CAIQ，Beijing100029，China）

Tri－sodium citrate with aqueous gold chloride was warmed up and mixed to make 25 nm colloidal gold particles under the conditions of pH7.6 and 13μg／mL protein.Test line and control line on nitrocellulose filter were spread to assemble immunostrip.The results indicated that the virus could be tested specifically on immunostrip within 10 minutes，and the sensitivity was a dilution of 104－fold purifiedSquashmosaicvirus.

Squashmosaicvirus； gold immunochromatography assay； immunostrip

S 432.41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.017

2011－12－15

2012－01－10

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008IK234）；國(guó)家質(zhì)檢公益性項(xiàng)目（200111035）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”）項(xiàng)目（2011CB932800）

＊ 通信作者E－mail：liangxm＠bjciq.gov.cn