煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）的快速檢測技術

張 盼， 宋國華， 喬 奇， 秦艷紅，張德勝， 田雨婷， 鄭文明， 張振臣＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，鄭州 450002；3.河南省許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心，許昌 461000）

煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）的快速檢測技術

張 盼1，2， 宋國華3， 喬 奇2， 秦艷紅2，張德勝2， 田雨婷2， 鄭文明1， 張振臣2＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，鄭州 450002；3.河南省許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心，許昌 461000）

建立了利用NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV的方法，比較了3種檢測方法的靈敏性。結(jié)果表明，NCM－ELISA最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測出SPCSV；RT－PCR能穩(wěn)定地從3頭以上帶毒煙粉虱中檢測出SPCSV；半巢式RT－PCR能穩(wěn)定地從單頭煙粉虱中檢測出SPCSV。檢測靈敏性研究表明，用體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為核酸模板，RT－PCR可檢測的最低濃度為5.69×104拷貝／μL，半巢式RT－PCR為5.69×101拷貝／μL，說明半巢式RT－PCR檢測方法的靈敏性比RT－PCR高1 000倍。

甘薯褪綠矮化病毒； 煙粉虱； 硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定； 半巢式RT－PCR

甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochloroticstunt virus，SPCSV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）成員。該病毒的基因組為雙組分單鏈正義RNA，基因組大小為17.6kb左右［1］。根據(jù)血清學關系和核苷酸序列，SPCSV可劃分為東非（EA）和西非（WA）兩個株系［2］。20世紀70年代首先在非洲發(fā)現(xiàn)了SPCSV，目前主要分布在非洲和南美的一些國家［3］。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特別重要的是，SPCSV可與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotatofeatherymottle virus，SPFMV）協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet potato virus disease，SPVD）。SPVD 是甘薯上最嚴重的病毒病害之一，通常可使甘薯減產(chǎn)50%～98%，甚至絕收［3－4］。

2010年Qiao等［5］首先報道了SPCSV在我國的發(fā)生。張振臣等［6］在我國廣東、江蘇、四川、安徽等主要甘薯產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)了SPVD的存在，說明SPVD在我國已有較廣泛的分布。SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由煙粉虱（Bemisiatabaci）以半持久方式傳播［7］，感染SPCSV的甘薯通常會迅速的形成SPVD，SPVD的流行跟煙粉虱的數(shù)量密切相關［8］。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的檢測煙粉虱中SPCSV的方法，對于該病的預警和防治具有重要意義。近年來，硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM－ELISA）［9］，反 轉(zhuǎn)錄 － 聚 合 酶 鏈 式 反 應（RT－PCR）［10］，巢式 RT－PCR［11］等方法已經(jīng)被用于傳毒昆蟲中病毒的檢測，但目前尚未見針對煙粉虱中SPCSV檢測方法的研究報道，為此，我們建立了利用 NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式 RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV的方法，比較了3種檢測方法的可靠性和靈敏性，期望獲得一種快速、高效的檢測煙粉虱體內(nèi)SPCSV的方法。

1 材料與方法

1.1 供試毒源和煙粉虱

將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)用于飼養(yǎng)煙粉虱，將經(jīng)過飼養(yǎng)3d以上的煙粉虱成蟲視為帶毒煙粉虱。無毒煙粉虱采自棉花田，每年7－9月份從河南省農(nóng)業(yè)科學院原陽試驗基地的大田棉花上采集煙粉虱成蟲，用健康的四季小白菜飼養(yǎng)兩周后作為陰性對照。收集帶毒煙粉虱成蟲和無毒煙粉虱成蟲用液氮速凍后，置于－70℃保存?zhèn)溆?。將?jīng)過NCM－ELISA和RT－PCR檢測SPCSV為陰性的甘薯莖尖培養(yǎng)試管苗作為甘薯陰性對照。

1.2 試劑及試劑盒

SPCSV的硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM－ELISA）檢測試劑盒購自國際馬鈴薯中心（CIP）；UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術公司；RNase抑制劑、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA 聚合酶、pMD19－T載體、T7RNA Polymerase購自TaKaRa公司。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中已登錄的SPCSVhsp70基因的核苷酸序列設計3條引物CSV70P1：5′－GACGG（G／T）GGTAC（G／T）ATGAA（A／G）GTCC－3′，CSV70P2：5′－GGCTCACAAAC（A／T／C）GA（C／T）TTCATAAACAT－3′，CSV70P3：5′－TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG－3′。 其 中，CSV70P1和CSV70P2用作半巢式RT－PCR的第1輪擴增，預期擴增片段大小為431bp；CSV70P1和CSV70P3用作半巢式RT－PCR的第2輪擴增引物，預期擴增片段大小為170bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 NCM－ELISA檢測煙粉虱中SPCSV

用解剖針挑取煙粉虱成蟲放入1.5mL離心管中，加入100μL抽提緩沖液，用研磨棒充分研磨，5 000r／min離心3min。取上清液5μL點于硝酸纖維素膜上，室溫晾干，然后按照NCM－ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。首先將膜浸入封閉緩沖液中室溫封閉1h，洗滌后加入SPCSV特異性抗體溶液，室溫孵育過夜；然后棄去抗體溶液，洗滌后加入酶標抗體溶液，室溫孵育1h；最后，棄去酶標抗體溶液，洗滌后加入底物溶液，顯色60min，蒸餾水洗膜終止反應。陽性樣品在膜上形成紫色沉淀，陰性樣品則無顏色反應。利用NCM－ELISA方法分別對1、2、4、8、16、32、64、128頭和256頭煙粉虱中的SPCSV進行檢測，分別以無毒煙粉虱和SPCSV CP基因的原核表達蛋白作為陰性和陽性對照。同樣的處理，重復檢測3次，以測試結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.5 RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV

用解剖針挑取單頭煙粉虱成蟲放入加有30μL預冷的RNA提取液的1.5mL離心管中，用DEPC處理過的研磨棒充分研磨，再用170μL的抽提液沖洗研磨棒，然后按照UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒說明書，提取煙粉虱成蟲體內(nèi)總RNA。利用RT－PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄體系為：4μL RNA 模板，2μL 5×RT buffer，0.5μL CSV70P2（10μmol／L），1μL dNTPs（10mmol／L），0.25μL RNase抑制劑（40U／μL）和0.5μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶 （5U／μL），用 DEPC－H2O 補足 10μL，42℃反轉(zhuǎn)錄40min，99℃5min，5℃5min。PCR反應體系為：2.5μL cDNA，2.5μL 10×PCR buffer，1μL dNTPs（2.5mmol／L），0.5μL CSV70P1（10μmol／L）和CSV70P2（10μmol／L），0.2μLTaq酶（5U／μL），用ddH2O補足25μL。PCR反應條件：94℃預變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。

1.6 半巢式RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV

取4μL核酸模板按1.5中的條件進行首輪RT－PCR擴增，將擴增產(chǎn)物稀釋20倍后，取1μL產(chǎn)物作為第2輪PCR擴增的模板，第2輪PCR擴增體系為：2.5μL 10×PCR buffer，1μL dNTPs（2.5mmol／L），0.5μL CSV70P1（10μmol／L）和CSV70P3（10μmol／L），0.2μLTaq酶（5U／μL），用ddH2O補足25μL。PCR反應條件：94℃預變性2min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，完成32個循環(huán)，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物的電泳、染色及成像同1.5。

1.7 RT－PCR和半巢式 RT－PCR產(chǎn)物的克隆和序列測定

將部分RT－PCR和半巢式RT－PCR產(chǎn)物進行純化，分別與pMD19－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成。利用DNAMAN和BLAST軟件對所測序列進行比較分析。

1.8 RT－PCR和半巢式 RT－PCR檢測SPCSV的靈敏性比較

按照T7RNA Polymerase說明書進行RNA體外轉(zhuǎn)錄。在上游引物CSV70P1的5′端引入T7啟動子序列，以SPCSVhsp70基因的重組質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，擴增的雙鏈DNA片段（454bp）在T7 RNA聚合酶的作用下經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA（cRNA），純化后用核酸測定儀測得cRNA濃度為148.1ng／μL，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度換算為5.69×1011拷貝／μL（cRNA 含量＝6.02×1023×148.1×10－9／（454×345）＝5.69×1011拷貝／μL）。將該cRNA用DEPC－H2O按10倍梯度稀釋成5.69×1010～5.69×101拷貝／μL，分別取濃度為5.69×107～5.69×101拷貝／μL的7個濃度梯度的RNA作為檢測模板，分別按照1.5和1.6方法進行RT－PCR和半巢式RT－PCR靈敏性檢測，比較兩者靈敏性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCM－ELISA檢測煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

以SPCSV特異性抗體作為一抗，應用NCMELISA方法分別檢測1、2、4、8、16、32、64、128頭和256頭煙粉虱中的SPCSV。結(jié)果表明，NCMELISA方法最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測出SPCSV，相同數(shù)量的無毒煙粉虱和健康甘薯檢測結(jié)果為陰性（圖1）。同樣的處理重復檢測3次，靈敏性和特異性結(jié)果均相同。

圖1 NCM－ELISA檢測煙粉虱中SPCSV

2.2 RT－PCR檢測煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

以提取的煙粉虱總RNA為模板，利用引物CSV70P1／CSV70P2進行 RT－PCR擴增。結(jié)果表明，從10、5、3、2和單頭帶毒煙粉虱中均能擴增出一條大小為431bp的特異性條帶，而從無毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗均中未能擴增出相應的條帶（圖2）。為了檢驗RT－PCR檢測帶毒煙粉虱的穩(wěn)定性，分別對單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱各進行了10次RT－PCR重復試驗，發(fā)現(xiàn)單頭煙粉虱中SPCSV的檢出率是40%，2頭檢出率為60%，3頭的檢出率為100%。說明利用RT－PCR方法能穩(wěn)定檢測出3頭煙粉虱中的SPCSV。

圖2 RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV

2.3 半巢式RT－PCR檢測煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

采用半巢式RT－PCR分別對單頭、2頭、3頭帶毒煙粉虱中SPCSV的帶毒情況進行檢測。結(jié)果顯示，半巢式RT－PCR從單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱體內(nèi)均能擴增出170bp的目的條帶，而不能從無毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗中擴增出相應條帶（圖3）。對單頭帶毒煙粉虱進行了10次半巢式RT－PCR重復檢測，陽性率為100%。說明利用半巢式RT－PCR方法能穩(wěn)定檢測出單頭煙粉虱中的SPCSV。

圖3 半巢式RT－PCR檢測煙粉虱中SPCSV

2.4 RT－PCR和半巢式RT－PCR產(chǎn)物的序列測定

RT－PCR和半巢式RT－PCR擴增出的片段序列測定結(jié)果表明，所克隆片段的核苷酸序列與SPCSV WA株系的相似性為97.6%～100%，說明兩種方法所擴增出的片段均為SPCSV的特異性片段。

2.5 RT－PCR和半巢式 RT－PCR 檢測SPCSV的靈敏性比較

以制備的SPCSV的cRNA作為模板，進行RT－PCR檢測，結(jié)果表明，RT－PCR可檢測的cRNA最低濃度為5.69×104拷貝／μL（圖4）。以第1輪RT－PCR的擴增產(chǎn)物為模板，進行半巢式RT－PCR擴增，結(jié)果半巢式RT－PCR最低能從濃度為5.69×101拷貝／μL的cRNA中檢測出SPCSV（圖5），表明建立的半巢式RT－PCR的檢測靈敏度比RT－PCR高1 000倍。

圖4 RT－PCR檢測SPCSV的靈敏性

圖5 半巢式RT－PCR檢測SPCSV的靈敏性

3 討論

本試驗采用了 NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式RT－PCR 3種方法對煙粉虱中的SPCSV進行檢測，3種方法均能從帶毒煙粉虱中檢測出SPCSV，但靈敏性有差異。NCM－ELISA的檢測靈敏性最低，RT－PCR 其 次，半 巢 式 RT－PCR 最 高。NCMELISA方法比較簡便、經(jīng)濟，在很小的NC膜上可以進行大量樣品檢測，結(jié)果可以長期保存，但檢測靈敏度相對較低，最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測出SPCSV。RT－PCR能從單頭煙粉虱中檢測出SPCSV，但由于每頭煙粉虱中的帶毒量可能不同，以及RNA提取與反轉(zhuǎn)錄過程中會造成部分RNA的損失，檢測單頭煙粉虱時不太穩(wěn)定，有假陰性情況的出現(xiàn)。本試驗經(jīng)過多次重復，發(fā)現(xiàn)只有從3頭以上的帶毒煙粉虱中才能穩(wěn)定地檢測出SPCSV。半巢式RT－PCR的檢測靈敏度最高，比RT－PCR的靈敏度高1 000倍，能從單頭帶毒煙粉虱體內(nèi)穩(wěn)定地檢測出SPCSV，可防止因病毒含量低而漏檢。此外，半巢式RT－PCR通過第2輪PCR擴增，可以進一步驗證第1輪RT－PCR擴增產(chǎn)物的特異性，其擴增結(jié)果的穩(wěn)定性也高于RT－PCR。

SPCSV的長距離傳播主要通過種薯和種苗，而短距離主要通過煙粉虱進行傳播［7－8，12］。煙粉虱生存能力強、繁殖速度快，據(jù)報道，煙粉虱經(jīng)過48h的飼毒就能進行有效傳染，而且煙粉虱的數(shù)量越大，病毒傳播的有效性越強［8，12］，因此，建立高效快速的檢測方法，加強對煙粉虱帶毒情況的監(jiān)測，對于該病毒的預警和防治具有重要意義。我國自2010年首次發(fā)現(xiàn)SPCSV以來［5］，目前在全國多個甘薯種植區(qū)陸續(xù)檢測到該病毒病的存在［6］，由于對SPCSV尚無特別有效的防治方法，做好煙粉虱帶毒率的檢測，加強對煙粉虱的防治，可有效減少SPCSV的蔓延擴散，減少病害引起的損失。

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Rapid detection technologies of theSweetpotatochlorotic stuntvirusinBemisiatabaci

Zhang Pan1，2， Song Guohua3， Qiao Qi2， Qin Yanhong2， Zhang Desheng2，Tian Yuting2， Zheng Wenming1， Zhang Zhenchen2
（1.CollegeofLifeSciences，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.InstituteofPlantProtection，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.AgriculturalProductsQualitySafetyTestingandInspectionCentreinXuchang，Xuchang461000，China）

The methods of NCM－ELISA，RT－PCR and semi－nested RT－PCR were used to detect theSweetpotato chloroticstuntvirus（SPCSV）in the whiteflyBemisiatabaci，and the sensitivities of these methods were compared.The results showed that SPCSV could be detected from at least 16 whiteflies carrying the virus by NCMELISA，occasionally from single whitefly and steadily from more than three whiteflies by RT－PCR；SPCSV could be steadily detected from single insect by semi－nested RT－PCR.WithinvitroRNA transcript as template，the sensitivity were up to5.69×104copies／μL and5.69×101copies／μL by RT－PCR and semi－nested RT－PCR，respectively，indicating that the detection sensitivity of the semi－nested RT－PCR was 1 000 times higher than that of the RT－PCR.

Sweetpotatochloroticstuntvirus（SPCSV）；Bemisiatabaci； NCM－ELISA； semi－nested RT－PCR

S 432.41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.016

2011－12－26

2012－04－25

國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目（CARS－11－B－07）

＊ 通信作者Tel：0371－65711547；E－mail：zhangzhenchen＠126.com