甘肅省馬鈴薯壞疽病病原鑒定

文朝慧， 何蘇琴， 荊卓瓊

（1.甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局，蘭州 730020；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

甘肅省馬鈴薯壞疽病病原鑒定

文朝慧1， 何蘇琴2＊， 荊卓瓊2

（1.甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局，蘭州 730020；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

本文通過Koch’s法則以及形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)甘肅省蘭州市馬鈴薯壞疽病進(jìn)行病原鑒定。從馬鈴薯壞疽病標(biāo)樣中分離得到5株形態(tài)特征一致的產(chǎn)生分生孢子器的腔孢綱真菌，其代表菌株GSAA－0232對(duì)馬鈴薯塊莖具有強(qiáng)的致病性，用該菌接種馬鈴薯塊莖，可引起與自然發(fā)病相同的壞疽病癥狀。該菌的培養(yǎng)物生成代謝物“E”（NaOH斑反應(yīng)顯示出特有的紫紅色）。利用引物Phoma－2／Phoma－7可擴(kuò)增出474bp的Phomafoveata特異條帶。根據(jù)其形態(tài)特征、生物學(xué)特性、致病性及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 （GenBank登錄號(hào)：JQ963624），將菌株GSAA－0232鑒定為Boeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆Verkley。這是Boeremiafoveata引起馬鈴薯壞疽病在我國的首次報(bào)道。

馬鈴薯； 壞疽??；Boeremiafoveata；Phomafoveata

隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，馬鈴薯已成為甘肅省重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積和總產(chǎn)量在國內(nèi)都名列前

茅［1］，2011年全省馬鈴薯播種面積達(dá)700 000hm2［2］。隨著馬鈴薯集約化程度的提高，馬鈴薯貯藏期腐爛問題也日漸突出［3－4］。

2002、2009年，作者在蘭州市榆中、皋蘭出產(chǎn)的馬鈴薯薯塊中發(fā)現(xiàn)了壞疽病病薯，并對(duì)病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及配方

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

OA：燕麥片20g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

MEA：麥芽浸粉40g，瓊脂粉12g，自來水1 000mL。

1.2 病害癥狀描述

根據(jù)自然感病和人工接種發(fā)病薯塊進(jìn)行癥狀描述。

1.3 標(biāo)樣采集和病原分離

病薯標(biāo)樣采集自蘭州榆中和皋蘭菜農(nóng)自產(chǎn)自銷的商品薯，取病健交界處病組織做常規(guī)分離，挑取尖端菌絲進(jìn)行純化。

1.4 病菌致病性測定

用直徑0.5cm打孔器在經(jīng)75%乙醇表面消毒的健康馬鈴薯薯塊上打一深0.5cm小孔，將在PDA平板上20℃培養(yǎng)4d的直徑0.5cm病菌菌絲塊接種于孔中，再將原薯塊組織塞回并用透明膠帶封口，置5℃和15℃培養(yǎng)，不接菌為對(duì)照，每處理5個(gè)馬鈴薯薯塊。16d后切薯調(diào)查發(fā)病情況并對(duì)發(fā)病薯塊進(jìn)行病原菌再分離。

1.5 病原菌形態(tài)特征及生物學(xué)特性研究

切取直徑5mm的菌絲圓片移植于PDA平板中央，分別于5、10、15、20、25、30、35℃下恒溫培養(yǎng)，6d后測量菌落直徑，觀察記載病菌培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征。每處理重復(fù)3次；繼續(xù)培養(yǎng)至20～40d，觀察測量分生孢子器及器孢子的形態(tài)和大小。

取直徑5mm的菌絲圓片移植于OA、MEA平板中央，20℃黑暗培養(yǎng)7d，測量菌落直徑，描述菌落形態(tài)；然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)放到13h近紫外燈＋11h黑暗／d，20℃培養(yǎng)，以刺激菌落色素的產(chǎn)生和分生孢子器的生成，7d后再次描述菌落形態(tài)，并在菌落邊緣滴加1mol／L NaOH 水溶液，觀察色斑反應(yīng)［5－6］。

1.6 PCR－RFLP

將待鑒分離物置PDA培養(yǎng)基、20℃、黑暗條件下培養(yǎng)5d，刮取菌落邊緣新鮮菌絲，采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA為擴(kuò)增模板，利用特異引物Phoma－2：5′－GGACCCCTGTACTGACGTC－3′和 Phoma－7：5′－AGC GGCTAGGATAGACAGGCG－3′，擴(kuò)增病菌基因組DNA中的特異片段［7］。PCR反應(yīng)體系總體25μL：10×Taqreaction buffer 2.5μL，1.5mmol／L MgCl22μL，dNTPs（2.5mmol／L）1μL，引物（20μmol／L）各0.5μL，Taq（5U／μL）0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)足25μL體積。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃15s，62℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。預(yù)期產(chǎn)物經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化和PCR鑒定后，純化質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序。測序結(jié)果與NCBI／GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行BLASTn比對(duì)，確定與試驗(yàn)菌株的相關(guān)性。

分別用限制性內(nèi)切酶DdeⅠ和DpnⅡ酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物，10μL體系：5μL PCR反應(yīng)液，0.5μL限制性內(nèi)切酶溶液，1μL緩沖液，ddH2O補(bǔ)足體積，37℃酶切3h。產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒別PCR反應(yīng)產(chǎn)物的DdeⅠ和DpnⅡ的酶切圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

病薯外表可見不規(guī)則黑褐色稍凹陷斑塊，切開病薯，薯內(nèi)形成大的孔洞，腐爛組織呈淡褐色、深紅褐色或深褐色，自然發(fā)病的病薯一般自臍點(diǎn)或有傷痕處形成侵染（圖1a～c）。

2.2 病原分離結(jié)果

從典型壞疽病癥狀的馬鈴薯病薯上分離得到5株菌落形態(tài)一致的褐色、產(chǎn)生分生孢子器的腔孢綱真菌，將其中的代表菌株編號(hào)GSAA－0232。

2.3 病菌致病性測定結(jié)果

不同溫度條件下病害癥狀及嚴(yán)重度不同：15℃下，病斑深紅褐色，在薯內(nèi)形成大的裂孔，表皮黑褐色，不規(guī)則，稍下陷，病斑長16～31mm（平均21.3mm），寬14～25mm（平均18.0mm），深22～29mm（平均25.3mm）；5℃下，病斑淡紅褐色至淡褐色，病組織糟松狀，有時(shí)有小的開裂，表皮黑褐色，不規(guī)則，稍下陷，病斑長15～19mm（平均17.0mm），寬13～16mm（平均14.7mm），深10～14mm（平均12.0mm）。15℃下薯塊受害較5℃下嚴(yán)重。對(duì)照未發(fā)病。

15℃回接發(fā)病的馬鈴薯塊莖表現(xiàn)出與自然病薯相同的癥狀。從回接發(fā)病馬鈴薯塊莖中可100%分離得到原接種病菌。

2.4 病原菌菌落形態(tài)和生物學(xué)特性

GSAA－0232在PDA平板上，20℃培養(yǎng)7d，菌落直徑（69.7±0.5）mm，菌落灰褐色，邊緣白色，菌落背面黃褐色；培養(yǎng)20d，菌落紅褐色，表層的網(wǎng)狀菌絲上散生大量黑色微粒狀分生孢子器，菌落表面散布無色透明微小水珠，菌落背面可見大小不等的黑褐色斑塊。

GSAA－0232在OA平板上，20℃培養(yǎng)7d，菌落直徑（72.2±0.6）mm，菌落黃褐色，邊緣整齊，幾乎沒有氣生菌絲，菌落背面黃褐色；培養(yǎng)14d，菌落深豆沙色，氣生菌絲薄而稀疏，邊緣稍多；培養(yǎng)基內(nèi)生大量深褐色斑塊，菌落背面與正面色同。

GSAA－0232在MEA平板上，20℃培養(yǎng)7d，菌落直徑（70.7±1.2）mm，菌落淡黃褐色，邊緣整齊，氣生菌絲薄氈狀，菌落背面亮黃褐色；培養(yǎng)14d，菌落黃褐色，氣生菌絲薄氈狀，菌落表面散生暗褐色分生孢子器，菌落背面亮黃褐色，可見黃色粉粒狀結(jié)晶。

NaOH斑反應(yīng)顯示出特有的紫紅色，顯示菌株GSAA－0232生成代謝物“E”（即可擴(kuò)散的蒽醌色素，在酸性條件下蒽醌色素呈黃色，在堿性條件下呈紅色）［5－6］。

GSAA－0232菌落形態(tài)及 NaOH斑反應(yīng)見圖1d～g。

菌絲的適宜生長溫度為15～20℃；30℃和35℃下菌絲不生長，在30℃和35℃下培養(yǎng)5d后，將培養(yǎng)皿移至20℃，30℃下培養(yǎng)5d的接種體可恢復(fù)生長，35℃下培養(yǎng)5d的僅有1／3的接種體可恢復(fù)生長（圖2）。

圖1 馬鈴薯壞疽病癥狀、菌落形態(tài)及NaOH色斑反應(yīng)

圖2 溫度對(duì)GSAA－0232菌絲生長的影響（PDA平板，培養(yǎng)6d）

GSAA－0232的顯微形態(tài)特征：PDA平板20℃培養(yǎng)，菌絲無色至褐色，粗菌絲10.0～12.5μm；中等粗菌絲3.7～8.7μm；細(xì)菌絲1.3～2.5μm；分生孢子器壇形，散生或聚生于培養(yǎng)基表面及培養(yǎng)基內(nèi)，深褐色，常被褐色網(wǎng)狀菌絲包圍，孔口不明顯，直徑89.1～198.0μm，平均139.8μm；高108.9～297.0μm，平均162.5μm；器孢子單孢，無色，壁薄，兩端鈍圓的短柱狀、長橢圓形、香蕉形，甚至不規(guī)則形，孢子均勻或一端稍大，直或略彎，（3.0～7.5）μm×（2.0～3.0）μm，平均（5.3×2.4）μm。在 MEA 平板20℃培 養(yǎng)，器 孢 子 大 小 為 （4.0～7.5）μm× （1.2～2.5）μm，平均（5.4×1.8）μm（圖3）。

圖3 GSAA－0232顯微形態(tài)特征

2.5 PCR－RFLP結(jié)果

引物Phoma－2／Phoma－7在菌株 GSAA－0232中擴(kuò)增出約474bp的Phomafoveata特異條帶［7］。

測序后經(jīng)BLAST比對(duì)表明，該序列（JQ963624）與Phomafoveata菌株79／139（AF079897.1）、ATCC 24771（AF079896.1）序列同源性為100%。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DdeⅠ酶切后產(chǎn)生256bp和118bp 2個(gè)條帶，經(jīng)DpnⅡ酶切后產(chǎn)生267bp和207bp 2個(gè)條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖4）。

圖4 PCR檢測及酶切圖譜

3 結(jié)論與討論

從蘭州馬鈴薯壞疽病病薯中分離得到菌落形態(tài)一致的產(chǎn)分生孢子器的腔孢綱真菌，其代表菌株GSAA－0232對(duì)馬鈴薯塊莖具有強(qiáng)的致病性，培養(yǎng)物生成代謝物E（NaOH斑反應(yīng)顯示出特有的紫紅色），利用引物 Phoma－2／Phoma－7可擴(kuò)增出474bp的Boeremiafoveata（＝Phomafoveata）特異條帶。根據(jù)其形態(tài)特征、生物學(xué)特性、致病性及分子檢測結(jié)果，將菌株GSAA－0232鑒定為Boeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆ Verkley。

Boeremia屬是Aveskamp等于2010年建立的新屬［8－9］。Aveskamp 等 采 用 多 位 點(diǎn) 序 列 分 型 法（multilocus sequence type，MLST）對(duì)206個(gè)分類單元（其中159個(gè)分類單元已知與Phoma關(guān)系密切）的378個(gè)菌株的LSU、SSU、ITS、TUB基因進(jìn)行了多重分析，依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果并結(jié)合形態(tài)學(xué)，建立了新屬BoeremiaAveskamp，Gruyter＆Verkley，8個(gè)新種，2個(gè)新變種，61個(gè)新組合。馬鈴薯壞疽病病原被新組合為Boeremiafoveata，該菌隸屬于子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門（Pezizomycotina），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢菌亞綱（Pleosporomycetidae），格孢腔菌目 （Pleosporales），Didymellaceae科，Boeremia屬：

Boeremiafoveata（Foister） Aveskamp，Gruyter＆Verkley 2010［Legitimate；MB515653］

Basionym ：PhomafoveataFoister 1940 ［Legitimate；MB289414］

Obligate synonym（s）：

PhomafoveataFoister 1940 ［Legitimate；MB289414］

Phomaexiguavar.foveata（Foister）Boerema 1967［Legitimate；MB350008］

Phomasolanicolavar.foveata（Foister）Malcolmson 1940［Legitimate；MB494129］

Phomasolanicolaf.foveata（Foister）Malcolmson 1958［Legitimate；MB350016］

Boeremiafoveata（＝Phomafoveata）最早發(fā)現(xiàn)于蘇格蘭的馬鈴薯塊莖［10］，之后在秘魯?shù)陌柕倨绽Z高原地區(qū)的昆諾藜（Chenopodiumquinoa）上發(fā)現(xiàn)該菌，并認(rèn)為南美高原可能是該菌的地理發(fā)源地［11］。

Boeremiafoveata引起的壞疽病是馬鈴薯貯藏期的重要病害，也是重要的檢疫性病害，已發(fā)生于澳洲、歐洲、北美洲和南美洲，病菌在土壤中可存活多年［12－13］。病菌還可侵染馬鈴薯的莖，病莖較健康莖早衰［14］。

在蘇格蘭，引起馬鈴薯塊莖壞疽病和干腐病的病原中，Boeremiafoveata引發(fā)病害的腐爛指數(shù)最高，其腐爛指數(shù)較Boeremiaexigua（＝Phomaexigua）高出5倍，較Phomaeupyrena高出10倍［15］。在澳大利亞的塔斯馬尼亞，馬鈴薯壞疽病病原中，Boeremiaexiguavar.exigua（＝Phomaexiguavar.exigua）所占比率為90%，Boeremiafoveata所占比率為10%［16］。

Boeremiaexiguavar.exigua是多主寄生真菌，已報(bào)道從超過200個(gè)屬的植物上分離到該菌，且無寄主?；F(xiàn)象［17］。在我國，梁力哲從辣椒種子上也分離到了該菌［18］。

由于Boeremiafoveata和Boeremiaexiguavar.exigua在形態(tài)特征上相似，而一些Boeremia foveata分離物又會(huì)喪失產(chǎn)生特征性蒽醌色素的能力［19］，給種類鑒定帶來了困難。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，一些分子檢測鑒定技術(shù)被用于Boeremia foveata的輔助鑒定［20－21］，其中 Macdonald等的方法具有較好的可重復(fù)性。本研究即采用Macdonald等的方法對(duì)病菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。

雖然馬鈴薯壞疽病具有較典型的病斑下陷、病健界限明顯等特征性癥狀，但在實(shí)際操作中，壞疽病與鐮刀菌引起的干腐病還是很容易混淆［22］。

本研究中，馬鈴薯壞疽病病薯率較低，3批次樣本的病薯率均低于1%。

這是Phomafoveata引起馬鈴薯壞疽病在我國的首次報(bào)道。研究菌株保存于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病害研究室。

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Identification of the pathogen of potato tuber gangrene in Gansu Province

Wen Zhaohui1， He Suqin2， Jing Zhuoqiong2
（1.GansuEntry－ExitInspectionandQuarantineBureau，Lanzhou730020，China；2.InstituteofPlantProtection，GansuAcademyofAgricultural Sciences，Lanzhou730070，China）

The pathogen of potato tuber gangrene in Gansu Province was identified through Koch’s rule and morphological characteristics，and specific fragment DNA sequence by using the specific primers Phoma－2／Phoma－7.Totally 5 strains were isolated from the diseased potato tubers with typical gangrene symptoms in Lanzhou City of Gansu Province in 2002 and 2009，and the pathogenicity was confirmed by Koch’s rule.A474－bp DNA fragment was amplified from the strain GSAA－0232 by using the specific primers Phoma－2／Phoma－7.The fungus produced an yellowish－brown anthraquinone pigment in culture，showing purplish red colour as well as drop of NaOH.Based on morphological characteristics，biological features，pathogenicity and molecular specialities（GenBank accession：JQ963624），the pathogen was identified asBoeremiafoveata（Foister）Aveskamp，Gruyter ＆Verkley.This is the first report of potato gangrene caused byB.foveatain China.

potato； gangrene；Boeremiafoveata；Phomafoveata

S 435.32

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.008

2012－05－01

2012－05－23

＊ 通信作者E－mail：gshesuqin＠sina.com