廣西烤煙棒孢霉葉斑病病原分子鑒定及其生物學(xué)特性補(bǔ)充

譚海文， 盧燕回， 王 雅， 陳振東， 袁高慶， 林 緯， 黎起秦＊

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西區(qū)煙草公司，南寧 530023）

廣西烤煙棒孢霉葉斑病病原分子鑒定及其生物學(xué)特性補(bǔ)充

譚海文1， 盧燕回2， 王 雅1， 陳振東1， 袁高慶1， 林 緯1， 黎起秦1＊

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西區(qū)煙草公司，南寧 530023）

本文對(duì)廣西烤煙棒孢霉葉斑病的病原進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。根據(jù)該病原菌的形態(tài)特征、致病性及rDNA－ITS序列測(cè)定，將引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病的病原菌鑒定為山扁豆生棒孢（Corynesporacassiicola）。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：27.5℃、培養(yǎng)初始pH為6、以麥芽糖作為C源、硝酸鉀作為N源及完全光照等條件最適合其菌絲生長(zhǎng)；30℃、以乳糖作為C源、硝酸鉀作為N源及完全黑暗等條件最有利于該菌分生孢子形成；27.5℃、濕度為100%＋水膜、12h光暗交替等條件最有利于分生孢子萌發(fā)；分生孢子的致死溫度為52℃。這是該病在廣西的首次報(bào)道。

烤煙棒孢霉葉斑病； 山扁豆生棒孢； 鑒定； 生物學(xué)特性

致 謝： 感謝本科生覃茜同學(xué)的熱心幫助。

＊ 通信作者E－mail：thwheaven＠163.com

烤煙棒孢霉葉斑病于1973年第一次在尼日利亞發(fā)現(xiàn)，部分煙區(qū)發(fā)病率達(dá)15%以上，造成相當(dāng)大的損失［1］。1998年，我國(guó)首次在貴州煙區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，局部煙區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，損失率高達(dá)15%～30%以上，當(dāng)時(shí)將其病原確定為棒孢霉屬（CorynesporaGüssow）一種［2］。2008年張中義先生將其鑒定為山扁豆生棒孢（多主棒孢）［Corynesporacassiicola（Berk.＆ Curst.）Wei］［3］。

2010年5月，廣西首次在羅城縣煙區(qū)發(fā)現(xiàn)烤煙棒孢霉葉斑??；2011年4－8月調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在廣西靖西縣、富川縣、德?？h及南丹縣煙區(qū)均有分布。

烤煙棒孢霉葉斑病主要危害烤煙成株期的中下部葉片，葉斑初為暗綠色小點(diǎn)，后轉(zhuǎn)為褐色小斑，并

具黃色暈圈，密集的小斑最終聯(lián)合為不規(guī)則形的褐色大病斑；中等大小的褐色病斑中部可見(jiàn)輪紋，濕度大時(shí)長(zhǎng)有褐色霉層；葉脈受害后表現(xiàn)為褐色至黑褐色并下陷的條斑（圖1a、b）。目前該病害在廣西屬零星發(fā)生，危害尚小。由于該病在廣西屬首次記載，作者對(duì)引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病的病原進(jìn)行了鑒定，并對(duì)病原的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株分離自廣西羅城縣煙區(qū)發(fā)病的煙葉，從病害癥狀表現(xiàn)明顯的煙株上采集新鮮標(biāo)本。用常規(guī)組織分離法分離［4］，經(jīng)單孢純化后的純培養(yǎng)菌株LC10－11保存于PDA培養(yǎng)基斜面上，置4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的致病性測(cè)定

分別以菌株的菌絲塊和孢子懸浮液作為接種體對(duì)其在煙葉上的致病性進(jìn)行測(cè)定。病原菌在PDA平板上培養(yǎng)7d后，分別用直徑為5mm的打孔器及滅菌水制成菌絲塊及濃度為40×鏡下每視野約100個(gè)孢子的孢子懸浮液。選擇健康煙株（品種為‘云煙97’）的中部煙葉進(jìn)行無(wú)傷口接種，葉片先用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗2～3次，分別將菌絲塊及孢子懸浮液接于葉片上，以無(wú)菌PDA培養(yǎng)基及無(wú)菌水作為對(duì)照處理。接種的葉片套袋保濕48h，置于25～30℃的溫室中，每隔2d觀察發(fā)病情況。接種發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌再分離，觀察分離得到的病原菌是否與接種菌株相同。

1.3 病原菌的形態(tài)特征觀察

將菌株移入PDA平板上，在28℃下培養(yǎng)9～15d，記錄菌落的顏色和形態(tài)。將直徑5mm菌絲塊接種到離體煙葉片上保濕培養(yǎng)6d，挑取發(fā)病葉片上的褐色霉層制作玻片。

在光學(xué)顯微鏡下，分別觀察PDA培養(yǎng)基及自然寄主上病菌的分生孢子、分生孢子梗及臍點(diǎn)等形態(tài)特征，并測(cè)量分生孢子的大小。

1.4 病原菌的rDNA－ITS序列測(cè)定

DNA提?。夯緟⒄瘴洳ǖ龋?］的SDS方法提取菌株基因組DNA。

PCR擴(kuò) 增［6］：采用 通 用引 物ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，ITS5： 5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′。擴(kuò)增體系包括10×PCR 緩沖液（含 Mg2＋）5.0μL，2mmol／L dNTP 5.0μL，5μmol／L ITS4 4.0μL，5μmol／L ITS5 4.0μL，5U／μLTaqDNA 聚合酶0.5μL，DNA 模板1.0μL，ddH2O 30.5μL，總體積50μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃變性40s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得的rDNA－ITS序列與GenBank中的核酸序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，查找同源性最高的病原菌序列。

1.5 病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定

接種菌絲塊的制?。涸诠┰嚲陱?fù)壯培養(yǎng)5d后，統(tǒng)一用直徑為5mm的打孔器在菌落邊緣制取。

孢子懸浮液的配制方法：用適量滅菌水沖洗培養(yǎng)12d后的菌落，濾去菌絲，稀釋成40×鏡下每視野約50個(gè)孢子的濃度。

用十字交叉法測(cè)量菌落直徑；用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量；用移液槍吸取60μL孢子懸浮液，涂于潔凈的載玻片上，保濕培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，每個(gè)重復(fù)檢查100個(gè)孢子。各處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及孢子萌發(fā)的影響

菌絲塊移入PDA平板上，分別置于12種溫度（7.5～42.5℃）條件的恒溫箱中培養(yǎng)，9d后測(cè)量各菌落大小，12d后測(cè)產(chǎn)孢量。

將涂有分生孢子懸浮液的載玻片，分別置于上述12種溫度的恒溫箱中保濕培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率。

1.5.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用1mol／L HCl或1mol／L NaOH 將滅菌后的PD培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至11種pH（2～12）水平，將菌絲塊分別移入不同pH的PD培養(yǎng)液中，置于恒溫?fù)u床（28℃、100r／min）振蕩培養(yǎng)，10d后稱(chēng)菌絲干重。

1.5.3 濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

分別用不同濃度的硫酸調(diào)節(jié)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度至50%、65%、75%、90%、100%。將孢子懸浮液涂于潔凈載玻片，快速風(fēng)干后，置于不同濕度的干燥器內(nèi)。28℃下培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，以相對(duì)濕度100%＋水膜中的孢子萌發(fā)率為對(duì)照。

1.5.4 不同光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)共設(shè)完全光照、12h光暗交替以及完全黑暗3種光照條件（21只36W的日光燈，燈距為15cm）。菌絲塊接入PDA平板上，分別置于28℃下的3種光照條件中培養(yǎng)，9d后測(cè)量菌落直徑，12 d后測(cè)產(chǎn)孢量。

將涂有孢子懸浮液的載玻片分別置于上述條件下保濕培養(yǎng)，24h鏡檢萌發(fā)率。

1.5.5 不同碳源氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子形成的影響

采用真菌生理培養(yǎng)基［7］（配方為：氮源1g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、碳源5g、瓊脂17g、蒸餾水1 000mL，高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌），以硝酸鉀為氮源，測(cè)定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、纖維素、D－甘露醇、肌醇和可溶性淀粉對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響；以蔗糖為碳源，測(cè)定硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、DL－丙氨酸、甘氨酸、大豆蛋白胨、酵母浸膏對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。測(cè)試的碳、氮源采用過(guò)濾滅菌法進(jìn)行滅菌。每種碳、氮源培養(yǎng)基倒平皿后移入菌絲塊，28℃下培養(yǎng)，9d后測(cè)量菌落直徑，20d后測(cè)產(chǎn)孢量。

1.5.6 致死溫度測(cè)定

用已滅菌的毛細(xì)管吸取分生孢子懸浮液（懸浮液體積占毛細(xì)管容積的1／3，避免用火封口時(shí)影響孢子活性），分別置于6種溫度（46～56℃，每2℃為一個(gè)梯度）的水浴鍋中處理10min后，取分生孢子液涂于潔凈載玻片上，28℃下保濕培養(yǎng)，24h后鏡檢萌發(fā)率，以孢子萌發(fā)率為零的處理作為孢子的致死溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致病性

無(wú)傷條件下，將菌株接種到健康的煙葉上，回接1～2d，接種孢子懸浮液和菌絲塊的煙葉全部發(fā)病。病斑初為水漬狀，后逐漸擴(kuò)展成圓形或近圓形的褐色葉斑，具黃色暈圈；葉脈受害后凹陷，變褐，對(duì)照煙葉不發(fā)病。從發(fā)病的病斑上能再分離到與接種菌形態(tài)一致的病原菌（圖1c、d）。

圖1 烤煙棒孢霉葉斑病癥狀

2.2 病原菌的形態(tài)特征

菌株在PDA平板上生長(zhǎng)良好，菌落圓形，平鋪，墨綠色至灰褐色，絨點(diǎn)狀，邊緣整齊，偶扇變，生長(zhǎng)到后期分泌黑褐色色素。分生孢子梗從菌絲垂直生出，單生或叢生，直立或彎曲，不分枝，淺褐色，光滑，可連續(xù)層出多次使孢子梗形成節(jié)節(jié)狀，頂端稍膨大。分生孢子頂生，單生，寄主上偶見(jiàn)2～3個(gè)孢子成鏈，PDA上幾十個(gè)孢子成鏈；寄主病斑上分生孢子長(zhǎng)圓柱形，大小為（41.8～127.2）μm×（6.1～11.8）μm，平均（113.5×8.4）μm；PDA培養(yǎng)基上分生孢子棒錐形，大小為（21.8～66.7）μm×（4.5～10.5）μm，平均（36.6×7.3）μm；分生孢子正直或彎曲，淡褐色，光滑，2～8個(gè)假隔膜，頂端鈍圓，基部近截形，臍點(diǎn)明顯（圖2）。

2.3 病原菌的rDNA－ITS序列測(cè)定結(jié)果

菌株經(jīng)過(guò)測(cè)序后獲得530bp的DNA序列（GenBank登錄號(hào)：JN034676），其堿基編碼序列中1～41bp為部分18SrRNA，42～190bp為ITS1，191～348bp為5.8SrRNA，349～511bp為ITS2，512～530bp為部分28SrRNA。GenBank檢索結(jié)果表明：與該菌株DNA－ITS序列同源性最高的100個(gè)菌株均為山扁豆生棒孢（多主棒孢）（Corynesporacassiicola），且同源性均為99%。

圖2 烤煙棒孢霉葉斑病菌

根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征及ITS序列同源性比較的結(jié)果，將引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病的病原鑒定為山扁豆生棒孢（多主棒孢）［Corynesporacassiicola（Berk .＆ Curt.）Wei］［2－3，8］。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及孢子萌發(fā)的影響

在PDA平板上，菌絲在低于10℃，高于37.5℃條件下不可生長(zhǎng)，10℃時(shí)菌絲僅在原菌塊上長(zhǎng)，生長(zhǎng)最適溫度為27.5℃，25～30℃時(shí)，菌落扇變；產(chǎn)生分生孢子的溫度范圍是20～32.5℃，最適溫度為30℃；分生孢子在無(wú)菌水膜條件下10～40℃均可萌發(fā)，最適溫度為27.5℃（表1）。

表1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成、孢子萌發(fā)的影響1）

2.4.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌株在pH 3～11范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適pH為6，pH5～8時(shí)次之（表2）。

表2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響1）

2.4.3 濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

孢子要在高濕度環(huán)境條件下才能萌發(fā)，相對(duì)濕度為90%時(shí)萌發(fā)率仍為0，最佳濕度為100%＋水膜，萌發(fā)率達(dá)100%，其次為相對(duì)濕度100%，萌發(fā)率為26.33%。

2.4.4 不同光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及孢子萌發(fā)的影響

光照處理對(duì)菌株生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響，完全光照條件下，菌絲生長(zhǎng)最快，且菌落最厚；完全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)稍慢，但最適宜產(chǎn)孢；12h光暗交替和完全黑暗更利于孢子萌發(fā)（表3）。

表3 不同光照處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)、孢子形成和孢子萌發(fā)的影響1）

2.4.5 不同碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子形成的影響

雙糖（麥芽糖、蔗糖、乳糖）及葡萄糖較利于菌株生長(zhǎng)發(fā)育，其中麥芽糖最利于菌絲生長(zhǎng)，乳糖最利于分生孢子形成；硝態(tài)氮（硝酸鈉、硝酸鉀）較利于菌株生長(zhǎng)發(fā)育，最適氮源為硝酸鉀，其次為硝酸鈉，菌株對(duì)銨態(tài)氮（氯化銨、硫酸銨）的利用最差（表4）。

2.4.6 致死溫度和時(shí)間測(cè)定

分生孢子在50℃水浴處理10min后，24h后鏡檢萌發(fā)率為26.53%。分生孢子在52℃及高于52℃的各溫度水浴處理10min后，24h后測(cè)定萌發(fā)率均為0。表明烤煙棒孢霉葉斑病菌分生孢子的致死溫度是52℃。

表4 碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響1）

3 討論

綜合病原菌的形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性以及rDNA－ITS序列分析結(jié)果，將引起廣西烤煙棒孢霉葉斑病的病原鑒定為山扁豆生棒孢（多主棒孢）（Corynesporacassiicola）。

廣西烤煙棒孢霉葉斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育適溫為25～30℃；孢子致死溫度為52℃；相對(duì)濕度低于100%時(shí)孢子不萌發(fā)，相對(duì)濕度越高越利于萌發(fā)。這些特性與關(guān)國(guó)經(jīng)等［9－10］報(bào)道的溫度對(duì)貴州烤煙棒孢霉葉斑病菌的影響及病菌侵染煙株的條件相吻合。表明烤煙棒孢霉葉斑病菌具有喜溫好濕的特點(diǎn)，這也是該病在高溫多雨季節(jié)易暴發(fā)的主要原因。

廣西烤煙棒孢霉葉斑病菌（C.cassiicola）在pH為5～8時(shí)生長(zhǎng)良好；菌絲在以麥芽糖為碳源和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好。這些特性與張春霞等［11］對(duì)橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌（C.cassiicola）報(bào)道一致。完全光照（20只36W 的日光燈，燈距為15cm）對(duì)該菌菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，完全黑暗更利于產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)；而鄒慶道等［12］報(bào)道光照（黑光燈，燈距為27cm）對(duì)黃瓜褐斑病菌（C.cassiicola）菌絲生長(zhǎng)速度影響不顯著，但光照有助于產(chǎn)孢。上述差異可能與試驗(yàn)用的菌株、光源以及光強(qiáng)等因素不同有關(guān)，其具體原因有待進(jìn)一步探討。

本研究?jī)H是對(duì)廣西烤煙棒孢霉葉斑病菌進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性初步測(cè)定，該病原菌的發(fā)生流行規(guī)律以及防治方法有待今后研究。

［1］朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國(guó)煙草病害［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：85－88.

［2］關(guān)國(guó)經(jīng)，張長(zhǎng)華，張永春，等.在貴州烤煙上發(fā)現(xiàn)由棒孢霉屬病菌引起的葉斑?。跩］.中國(guó)煙草科學(xué)，2000（1）：5－6.

［3］張中義，李繼新，關(guān)國(guó)經(jīng)，等.烤煙棒孢霉葉斑病病原菌鑒定［J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2008，14（6）：44－47.

［4］方中達(dá).植病研究方法［M］.第3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：122－125.

［5］武波，韋東，唐咸來(lái)，等.一株產(chǎn)絮凝劑的曲霉菌株的篩選［J］.微生物學(xué)雜志，2001，21（2）：3－5，38.

［6］Nnis M A，Gelfand D H，Snnsky D H，et al.PCR protocols：A guide to methods and applications［M］.San Diego，USA：Academic Press，1990：315－322.

［7］楊煥青，王開(kāi)運(yùn)，范昆，等.草莓枯萎病菌的生物學(xué)特性及7種殺菌劑對(duì)其抑制作用［J］.植物 保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（2）：169 －174.

［8］陸家云.植物病原真菌學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：372－373.

［9］關(guān)國(guó)經(jīng)，梁貴林，李繼新，等.溫度對(duì)烤煙棒孢霉葉斑病病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響［J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2006，12（1）：27－31.

［10］關(guān)國(guó)經(jīng)，梁貴林，李繼新，等.葉面水濕持續(xù)時(shí)間對(duì)烤煙棒孢霉葉斑病的影響［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2007，28（1）：29－31.

［11］張春霞，何明霞，李加智，等.橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病原菌的生物學(xué)特性［J］.植物保護(hù)，2010，36（2）：98－101.

［12］鄒慶道，傅俊范，朱勇，等.黃瓜褐斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究［J］.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（4）：258－261.

Molecular identification and a supplement to the biological characteristics of the pathogen causing flue－cured tobacco corynespora leaf spot in Guangxi

Tan Haiwen1， Lu Yanhui2， Wang Ya1， Chen Zhendong1， Yuan Gaoqing1， Lin Wei1， Li Qiqin1
（1.CollegeofAgriculture，GuangxiUniversity，Nanning530004，China；2.GuangxiTobaccoCompany，Nanning530023，China）

The identification of the pathogen causing flue－cured tobacco corynespora leaf spot in Guangxi and its biological characteristics were preliminarily studied.The pathogen of flue－cured tobacco corynespora leaf spot was identified asC.cassiicolabased on its morphology，pathogenicity and the analysis of sequences of ribosomal rDNA－ITS.The optimum temperature，pH value，carbon source，nitrogen source and light treatment for the mycelial growth ofC.cassiicolawere 27.5℃，6，maltose，potassium nitrate and full light，respectively.For the sporulation，the optimum temperature was 30℃，and the best carbon／nitrogen source was lactose／potassium nitrate，and full darkness was the most suitable light treatment.For conidial germination，the most favorite temperature，relative humidity and light treatment were 27.5℃，100%and 12 h alternate light，respectively.The lethal temperature for the spores was 52℃.It is the first report of the tobacco disease in Guangxi，China.

flue－cured tobacco corynespora leaf spot；Corynesporacassiicola； identification； biological characteristics

S 435.72

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.007

2012－01－04

2012－02－25

廣西煙草有害生物調(diào)查研究項(xiàng)目