RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定枇杷莖枝、葉中齊墩果酸和熊果酸的含量

陳白靈 蘇本偉

1.廣西玉林市骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000;2.廣西欽州市中醫(yī)院，廣西 欽州 535000

枇杷系薔薇科枇杷屬植物枇杷 (Eriobotrya Japonica(Thunb.)Lindl.)，廣泛分布于廣東、廣西、江蘇、福建、江西等地，具有較高的藥用價(jià)值［1］。近期對(duì)枇杷的研究主要集中于枇杷葉，研究表明其主要成分為三萜酸和倍半萜及其苷類，藥理活性的報(bào)道主要集中在三萜酸的抗炎、降血糖和抗病毒活性方面，齊墩果酸、熊果酸含量明顯占優(yōu)勢(shì)［2］。近年越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法測(cè)定枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量［3，4］，但對(duì)枇杷莖枝中熊果酸和齊墩果酸的含量測(cè)定尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定枇杷樹莖枝、葉中熊果酸和齊墩果酸的含量，具有準(zhǔn)確、靈敏、快捷的特點(diǎn)，為對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀;色譜柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);GH-252型電子分析天平 (AND)，BP121S型電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司);LG16-W高速微量離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠);KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山)。齊墩果酸對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物品檢定所，批號(hào)：110709-200505);熊果酸對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物品檢定所，批號(hào)：110742-200516);乙腈、甲醇 (CNW、色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純。樣品分別采自廣西巴馬、都安、欽州、玉林，采集時(shí)間為2011年5～7月，將采集的樣品洗凈陰干，枝、葉分開粉碎過45目備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 島津LC-20AT高效液相色譜儀;色譜柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨溶液 (12：67：21);檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm;流速1.0ml/min，柱溫：室溫。齊墩果酸、熊果酸可以達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度好，對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取齊墩果酸、熊果酸適量，加乙醇溶解并稀釋成每1ml中含0.209mg齊墩果酸、0.628mg熊果酸的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 樣品溶液制備 精密稱取樣品粉末0.50g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇溶液25mL，超聲提取30分鐘，冷卻補(bǔ)重，搖勻，離心，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，得樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 將齊墩果酸、熊果酸混合對(duì)照品溶液母液分別稀釋成質(zhì)量濃度為 2.61，13.06，26.13，52.25，104.50，209mg · L-1;7.85，39.25，78.50，157，314，628 mg·L-1對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10μl，記錄，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果齊墩果酸回歸方程為 Y=4427.6X+4738.7，r=0.9998，線性范圍為 2.61 ～209mg·L-1，熊果酸回歸方程為 Y=4987.6X+13576，r=0.9999，線性范圍為7.85～628mg·L-1，結(jié)果表明在上述濃度范圍內(nèi)，2成分濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0，1，2，4，6，8，12h進(jìn)樣10μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果齊墩果酸RSD=0.99%，熊果酸RSD=0.76%，表明樣品在12h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算 RSD，齊墩果酸 RSD=0.60%，熊果酸RSD=0.90%，結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批柿葉樣品，共5份，按“2.2”項(xiàng)制備樣品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量的RSD，齊墩果酸 RSD=0.80%，熊果酸 RSD=0.90%，，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的琵琶樣品6份，稱樣量約為制備量的一半，分別精密加入齊墩果酸、熊果酸適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，吸取10μl進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸、熊果酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同產(chǎn)地枇杷莖枝、葉齊墩果酸、熊果酸含量

2.9 含量測(cè)定 分別取樣品溶液10μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算齊墩果酸、熊果酸的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取方法的選擇，對(duì)提取溶劑和提取方法進(jìn)行了考察，選用甲醇、乙醇、乙醚作為提取溶劑，進(jìn)行了索氏提取、回流提取、超聲提取，結(jié)果顯示，甲醇和乙醇超聲提取30min即可，但考慮到成本及試劑的毒性，最終選擇乙醇作為提取溶劑，方法操作簡(jiǎn)便、快捷。

3.2 本實(shí)驗(yàn)對(duì)來自不同產(chǎn)地枇杷樹的莖枝及葉中齊墩果酸、熊果酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的枇杷樹中齊墩果酸、熊果酸的含量差異較大，其中以采自廣西欽州市的齊墩果酸、熊果酸含量最高，同一產(chǎn)地枇杷樹中同一部位齊墩果酸、熊果酸含量不同，熊果酸含量比齊墩果酸高，同一產(chǎn)地枇杷樹中不同部位齊墩果酸、熊果酸含量不同，莖枝比葉含量高。本實(shí)驗(yàn)所建立的含量測(cè)定方法可同時(shí)測(cè)定枇杷樹莖枝和葉中熊果酸和齊墩果酸的含量，具有準(zhǔn)確、靈敏、快捷的特點(diǎn)，為對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典第一部［S］.2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1067-1068.

［2］郭宇，吳松吉，樸惠善.枇杷葉的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(6)：928-930.

［3］杜豐玉，陳鈞，宣寒，等.RP-HPLC測(cè)定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸［J］.中成藥，2006，28(12)：1790-1793.

［4］羅曉清，郭小儀，俞學(xué)煒.RP-HPLC法測(cè)定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸［J］.中國(guó)野生植物資源，2004，23(5)：50-51.