人胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老的基因表達變化

李國棟 馬 宏 童坦君 張宗玉

(北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化系，北京 100191)

環(huán)境和遺傳是影響細(xì)胞和個體衰老進程的兩大因素，尤其是遺傳因素在衰老中發(fā)揮的作用正日漸得到學(xué)者們的重視。與腫瘤類似，衰老的啟動與進展不是由單一基因操縱的，而是受到一系列基因的協(xié)同調(diào)節(jié)。早期研究發(fā)現(xiàn)衰老過程伴有一些基因表達的上調(diào)及另一些基因表達的下調(diào)，這些基因的變化可作為該組織或細(xì)胞衰老的特異性生物學(xué)標(biāo)志。因此，尋找參與細(xì)胞或個體衰老過程的基因和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是衰老基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容之一?；蛐酒夹g(shù)以核算雜交理論為基礎(chǔ)，利用固定在芯片上的幾千至幾萬條探針與樣品的mRNA進行雜交，在一次實驗中獲取大量信息?；蛐酒夹g(shù)使用了光控固相化學(xué)、激光共聚焦等多項先進技術(shù)，實現(xiàn)了全部自動化，操作快速、簡便。芯片技術(shù)的應(yīng)用使得高通量分析細(xì)胞衰老等復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成為可能。盡管近年利用芯片技術(shù)對組織以及細(xì)胞衰老的研究逐漸增多，但是針對人胚肺成纖維細(xì)胞(2BS)復(fù)制性衰老的基因篩查仍未見報道。在此，我們用含有4 096種人類基因的基因芯片，檢測了2BS細(xì)胞在復(fù)制性衰老過程中的基因表達變化情況，結(jié)果顯示衰老細(xì)胞與年輕細(xì)胞相比有117種基因表達的變化幅度在2倍以上，變化幅度在2.5倍以上的基因有46種，而且我們挑選的9種差異表達基因經(jīng)RTPCR驗證與芯片結(jié)果基本一致。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 2BS細(xì)胞為衰老研究中心常規(guī)保存，細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長至90%融合時，以1∶2分瓶傳代。一般定義為:細(xì)胞代齡(PD)在PD30及以下的為年輕細(xì)胞，PD55及以上的為老年細(xì)胞。

1.2 基因芯片雜交 使用RNeasy mini kit(QIAGEN，Germany)試劑盒提取不同代齡2BS細(xì)胞的總RNA，細(xì)胞的收集和處理參照動物細(xì)胞的操作步驟。分光光度法對RNA定量并通過凝膠電泳對RNA完整性進行評價。mRNA的提取使用Oligotex mRNA Midi kit(QIAGEN，Germany)試劑盒。cDNA探針的制備和純化參照許沈華等〔1〕方法進行，Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分別用于標(biāo)記年輕2BS細(xì)胞(PD28)和衰老2BS細(xì)胞(PD64)的cDNA。標(biāo)記探針95℃變性5 min后，與含有4 096條人類全長基因的 HGEC-40S cDNA芯片 (Biostar Genechip，China)在60℃雜交15～17 h。雜交后的芯片用2×SSC+0.2%SDS、0.1×SSC+0.2%SDS、0.1%SSC 洗滌 3次，每次 10 min，室溫晾干。檢測結(jié)果使用GenePix 4000B掃描，數(shù)據(jù)分析使用Gene-Pix 3.0軟件。通過預(yù)先選定40個管家基因作為內(nèi)參基因?qū)y3和Cy5的原始信號進行均衡和修正。同時為了監(jiān)控芯片制備和雜交過程，設(shè)定水稻U2RNA、HCV外殼蛋白及空白液為陰性對照。

1.3 RT-PCR 從芯片結(jié)果中挑選9個在年輕和衰老2BS細(xì)胞中差異表達的基因進行RT-PCR驗證，β-actin作為對照基因(各基因的引物序列和產(chǎn)物大小見表1)。PCR反應(yīng)體系一般為20μl，包括 cDNA 模板3～5 μl，25 mmol/L MgCl21.6 μl，10 mmol/L dNTP 0.4μl，上下游引物的最終反應(yīng)濃度為0.4μmol/L，1 U的Taq DNA聚合酶。首先95℃變性1 min，每次循環(huán)包括95℃變性20 s，56～60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后，用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 年輕與衰老2BS細(xì)胞基因表達譜的差異分析 芯片檢測結(jié)果中Cy5與Cy3信號強度的比值(Cy5∶Cy3)反映了年輕與衰老2BS細(xì)胞差異表達基因的相對水平，其中Cy5:Cy3大于2.0的基因定義為在衰老細(xì)胞中高表達的基因，而Cy5∶Cy3小于0.5的基因為在衰老細(xì)胞中低表達的基因。在檢測的4 096條人類基因中，有117條基因的Cy5∶Cy3大于2.0或小于0.5，變化幅度在2.5倍以上的基因有46種，提示這些基因的表達很可能隨著2BS細(xì)胞的衰老發(fā)生了變化，其中部分基因列于表2。基因功能歸類分析顯示，細(xì)胞衰老過程中下調(diào)的基因主要是細(xì)胞分裂或細(xì)胞周期相關(guān)基因，上調(diào)的基因則主要參與了細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和蛋白分泌等生理過程，這與Ly等〔2〕報道的老年人皮膚成纖維細(xì)胞基因表達的變化相似。此外，差異表達的基因還涉及細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)重塑、物質(zhì)代謝與蛋白修飾以及G蛋白偶聯(lián)受體與離子通道等介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(表2)。

表1 PCR擴增基因的引物序列及產(chǎn)物長度

表2 年輕2BS細(xì)胞與衰老2BS細(xì)胞基因表達譜的差異

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 RT-PCR驗證部分基因在2BS細(xì)胞衰老過程中的變化我們挑選了9個在芯片檢測中發(fā)生表達改變的基因(表1)，它們在復(fù)制性衰老過程中的表達變化情況目前尚未見報道。分別提取 PD27、PD35、PD42、PD48、PD54、PD60、PD64 的 2BS 細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于對這些基因的RT-PCR驗證和分析。在所檢測的9個基因中，除Diubiquitin無明顯變化外，其余8個基因的表達變化趨勢與芯片檢測結(jié)果一致，表達上調(diào)的基因有 Laminin α4、G0S8、GRK4、VCAM1 和 Selenoprotein P，下調(diào)的有Preproenkephalin、Mad2和TPKC1(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測部分差異表達基因在不同代齡2BS細(xì)胞的表達

3 討論

體外培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)制性衰老作為一種個體衰老的簡化模型，其可靠性已得到廣泛的認(rèn)可，然而基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性一定程度上阻礙了衰老分子生物學(xué)研究的進展?；蛐酒夹g(shù)是揭示衰老分子機制的一個重要手段，1999年Lee等〔3〕首次將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于衰老體系，發(fā)現(xiàn)限制熱卡攝入可使老年鼠的基因表達譜向青年型轉(zhuǎn)化。Lerner領(lǐng)導(dǎo)的科研小組應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究了老年人及Huchinson-giford早老癥皮膚成纖維細(xì)胞基因表達情況，并將衰老推斷為細(xì)胞分裂檢控點失控的一種疾病〔2〕。在此，我們以含有4 096條人類基因的cDNA芯片檢測了2BS細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中的基因表達變化。cDNA芯片雜交結(jié)果顯示:2BS細(xì)胞的復(fù)制性衰老并不引起基因表達的廣泛變化，在所檢測的4 096條人類基因中，熒光強度值變化在2倍以上的基因僅有117條。表達下調(diào)的基因主要參與細(xì)胞周期的進程，如在促有絲分裂因子MPF核轉(zhuǎn)移過程中起作用的PLK和控制G2/M轉(zhuǎn)換的Cyclin B。表達上調(diào)的基因則主要包括參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和蛋白分泌等生理過程的分子，如凝血酶原活化因子(t-PA)、補體C3以及參與蛋白分泌途徑的TRAMP分子。在差異表達基因中，有些基因已被證實在復(fù)制性衰老的成纖維細(xì)胞中高表達，如參與胎兒肺成熟的角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)〔4〕隨年齡增加在肺成纖維細(xì)胞中的表達明顯升高，顯示可能與成人傷口愈合情況比胎兒差有關(guān)〔5〕。

我們挑選并利用RT-PCR進一步檢測了9個基因，它們在復(fù)制性衰老過程中的表達變化情況目前尚無報道，以下針對部分可能與衰老調(diào)節(jié)有關(guān)的基因進行討論。Preproenkephalin是衰老細(xì)胞中下調(diào)幅度最大的基因，其在年輕2BS細(xì)胞中表達很強，從PD39左右表達開始下調(diào)，PD51以后表達極弱，但在過氧化氫誘導(dǎo)的早老細(xì)胞中未檢測到前腦啡肽原基因表達的變化。研究顯示胞核內(nèi)腦啡肽水平的下降會導(dǎo)致抑郁行為，而前腦啡肽原敲除小鼠則不會出現(xiàn)抑郁表型〔6〕。鑒于Mianserin等抗抑郁藥可能通過模擬節(jié)食的作用延長線蟲的壽命〔7〕，因此前腦啡肽原及腦啡肽在細(xì)胞衰老中的作用值得進一步研究。衰老細(xì)胞下調(diào)幅度較大的基因中大部分與細(xì)胞有絲分裂進程相關(guān)，MAD2是細(xì)胞進入有絲分裂后期的檢控點蛋白。cDNA芯片和RT-PCR檢測結(jié)果均顯示MAD2在2BS細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中表達下調(diào)，而且我們在過氧化氫誘導(dǎo)的早老細(xì)胞中同樣檢測到MAD2 基因表達的下調(diào)〔8〕。

鉀離子流動是膜電位改變的主要因素，有關(guān)神經(jīng)突觸和紅細(xì)胞等衰老過程中伴有膜電位降低或鉀離子流動性的改變已見諸文獻〔9，10〕，但與成纖維細(xì)胞衰老的關(guān)系目前還未見報道。我們發(fā)現(xiàn)復(fù)制性衰老的2BS細(xì)胞中一種外向整流的鉀離子通道TPKC1表達下調(diào)，而一種內(nèi)向整流的TWIK-1的表達上調(diào);RT-PCR也驗證了TPKC1在2BS細(xì)胞衰老中的下調(diào)趨勢。我們推測TPKC1表達的下調(diào)可能是衰老細(xì)胞膜電位降低的原因之一。G0S8又稱G蛋白信號調(diào)節(jié)因子2(RGS2)，是唯一選擇性抑制Gqα的調(diào)節(jié)因子。2BS細(xì)胞衰老時G蛋白信號通路的負(fù)調(diào)控因子RGS2、RGS5及G蛋白耦聯(lián)受體激酶GRK4表達上調(diào)。由于RGS2和GRK4的表達上調(diào)均發(fā)生在2BS細(xì)胞的青年或中年時期(圖1)，因此推測他們的表達變化可能是成纖維細(xì)胞復(fù)制性衰老的早期事件之一。此外，RGS2基因缺失的老年小鼠表現(xiàn)為體重較輕而且脂肪沉積減少〔11〕，提示可能參與調(diào)控生理代謝過程而影響衰老。硒蛋白是指含有硒半胱氨酸的一類蛋白質(zhì)，人血漿中50%的硒元素是以硒蛋白P(Selenoprotein P)的形式存在的。近年研究表明:硒蛋白P可與過氧化亞硝酸及磷脂氫過氧化物反應(yīng)，參與細(xì)胞外抗氧化防御機制〔12〕。芯片結(jié)果和RT-PCR檢測均顯示衰老2BS細(xì)胞中硒蛋白P表達上調(diào)，這與衰老細(xì)胞中DNA鏈斷裂增加的現(xiàn)象似乎有些矛盾。Caldini等〔13〕曾報道:隨體外培養(yǎng)的MRC5成纖維細(xì)胞倍增次數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)另外一種含硒的、參與清除自由基的蛋白質(zhì)-谷胱甘肽過氧化物酶活性增強。因此我們推測衰老2BS細(xì)胞中硒蛋白P基因表達的上調(diào)是細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境活性氧基團濃度升高導(dǎo)致的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)。Miles等〔14〕發(fā)現(xiàn)人體血漿中血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM1)的濃度與年齡有良好的正線形關(guān)系，這與我們的檢測結(jié)果具有相同的變化趨勢;然而Shelton等〔15〕觀察到VCAM1在人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代過程中顯著下調(diào)。研究表明:轉(zhuǎn)入端粒酶催化亞單位基因可使內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞永生化，而且這兩種細(xì)胞復(fù)制性衰老時均表現(xiàn)端粒縮短、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色增加及特定的細(xì)胞周期分布，這說明體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞經(jīng)歷相似的衰老啟動事件，VCAM1表達差異與細(xì)胞的特異性有關(guān);而且它的表達變化不是啟動復(fù)制性衰老的早期事件，而是細(xì)胞衰老的效應(yīng)分子。

綜上所述，2BS細(xì)胞復(fù)制性衰老基因表達變化的主要特征是細(xì)胞周期進程相關(guān)基因的下調(diào)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)及分泌蛋白類基因的上調(diào)。基因表達譜的分析是細(xì)胞衰老和個體衰老研究中的一個重要手段，然而由于通過芯片等高通量分析技術(shù)獲得的基因信息往往數(shù)量巨大，難以建立簡單易測的分子生物學(xué)衰老指征。如果在對基因信息進行生物學(xué)分析的基礎(chǔ)上，針對部分感興趣的基因或聯(lián)合其他細(xì)胞學(xué)指征進行統(tǒng)計學(xué)分析將有助于細(xì)胞衰老的定性和定量評價，也有助于對細(xì)胞衰老基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。

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