牙周膜成纖維細(xì)胞對成骨細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量和堿磷酶活性的影響

梁 莉 劉洪臣 周 威 溫莉莎

牙周膜在健康狀態(tài)下保持生理和代謝平衡，源于其結(jié)構(gòu)中多種細(xì)胞通過一定的途徑相互作用，彼此間進(jìn)行數(shù)量和位置的相互調(diào)控[1]。其中，牙周膜成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞是牙周組織的兩種重要的細(xì)胞成分，它們對于維持正常牙周膜的生理功能起關(guān)鍵作用。本研究通過建立人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontalligamentfibroblastcells，HPLFs)與成骨細(xì)胞(Osteoblast cells，OB)transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，研究人牙周膜成纖維細(xì)胞對成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為深入探討正畸牙齒移動的生物學(xué)機(jī)制以及牙周膜形成和再生的相關(guān)因素奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床正畸治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1. 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(浙江金華清湖犢牛利用研究所)，胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，跨膜培養(yǎng)器(trainswell，孔徑 0.4/μm，Millipore，美國)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程公司)，DG-3022型酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(南京華東電子儀器廠)，抗波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體(Dako公司，丹麥)，SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定 選取11-13歲因正畸需要而拔除的前磨牙，無菌條件下刮取牙根中1／3的牙周膜組織，剪成1.0 mm×1.0mm×1.0mm小塊，平鋪于25ml培養(yǎng)瓶底，加入含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，0.25%胰酶消化，1∶2傳代。用波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體進(jìn)行染色鑒定。取4-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 人成骨細(xì)胞的培養(yǎng) 選用人成骨細(xì)胞株HOS TE85(由美國 UCSF細(xì)胞庫惠贈)。HOS TE85細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)。在37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 建立共同培養(yǎng)模型 先接種Obs 48h后，按millipore transwell的說明，放入transwell裝置，以保證培養(yǎng)液能上下相通，而裝置內(nèi)外的細(xì)胞被隔開，在transwell中加入人HPLFs。(見圖1)

圖1 細(xì)胞共培養(yǎng)模型

實(shí)驗(yàn)分為兩組：單獨(dú)培養(yǎng)的OBs組和與HPLFs共培養(yǎng)的OBs組。

1.5 人HPLFs對OBs增殖的影響 先取對數(shù)生長良好的OBs接種于24孔板，每孔1ml(含細(xì)胞104個(gè))，48h后，去培養(yǎng)液，按上述實(shí)驗(yàn)分組，加入人HPLFs，每孔2×105，每組各設(shè) 12個(gè)復(fù)孔。分別在1d、3d、5d、7d收集OBs，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.6 人HPLFs對OBs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響 取對數(shù)生長良好的OBs接種于24孔板，每孔1ml(含細(xì)胞104個(gè))，48h后，去培養(yǎng)液，按上述實(shí)驗(yàn)分組，加入HPLFs，每孔2×105，每組各設(shè)12個(gè)復(fù)孔。分別在1d、3d、5d、7d各取1塊培養(yǎng)板，收集OBs，置于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml(含細(xì)胞104個(gè))，再分別加入細(xì)胞裂解液200μ l，37℃裂解約4h，適當(dāng)吹打，收集裂解液。取裂解液 50μ l，加入底物 50μ 1，37℃保溫 5-20min，420nm波長測定A值，間接反映細(xì)胞堿性磷酸酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測量 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有顯著性。

2. 結(jié)果

2.1 HPLFs的生長情況 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的HPLFs呈星形或梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核呈圓形或卵圓形，核仁清晰(見圖2)。所培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)SABC免疫組織化學(xué)檢測呈抗波形絲蛋白陽性，抗角蛋白陰性，證明細(xì)胞為來源于中胚層的成纖維樣細(xì)胞。(見圖3)

圖2 HPLF細(xì)胞的形態(tài)(×100)

圖3 HPLF細(xì)胞波形絲蛋白染色(SABC，×200)

2.2 人HPLFs對OBs增殖的影響 從細(xì)胞生長曲線可以看出，1d時(shí)transwell共培養(yǎng)組OBs細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對照組，但兩組間無顯著性差異；3d和5d時(shí)transwell共培養(yǎng)組OBs細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為4.5×104及8.5×104，高于對照組，且兩組分別與對照組OBs細(xì)胞計(jì)數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)；7d時(shí)transwell共培養(yǎng)組HPLFs細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對照組，但兩組間細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性差異(見圖4)。

圖4 人HPLFs對OBs增殖的影響

2.3 人HPLFs對OBs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響 transwell共培養(yǎng)組與對照組相比，共培養(yǎng)組OBs ALP活性低于對照組。經(jīng)組間t檢驗(yàn)：在1d時(shí)兩組OBsALP活性無顯著性差異，3d時(shí)有顯著性差異(P＜0.05)，5d及7d時(shí)差異尤其顯著(P＜ 0.01)(見附表)。

附表 人HPLFs對OBs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響(±s)

附表 人HPLFs對OBs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響(±s)

＊P＜ 0.05＊＊P＜0.01與同時(shí)間對照組相比。n=12

?

3. 討論

成骨細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞都是牙周組織的重要組成成分，參與牙周正常生理代謝、創(chuàng)口愈合或牙種植界面形成。故成骨細(xì)胞與牙周膜成纖維細(xì)胞的關(guān)系在牙周膜的改建中處于核心地位[2,3]。

近年來發(fā)展起來的跨室聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)(transwellcoculture)，在研究炎癥趨化因子、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已應(yīng)用于口腔生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4,5]。此培養(yǎng)體系可以保證培養(yǎng)液能上下相通，而裝置內(nèi)外的細(xì)胞被隔開，使體外研究更能模擬體內(nèi)的微環(huán)境。本研究采用這種聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)用于研究人牙周膜成纖維細(xì)胞對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，建立了人成骨細(xì)胞與牙周膜成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)體系[8]，能夠更好地研究人牙周膜成纖維細(xì)胞對成骨細(xì)胞的影響。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在3d和5d時(shí)共培養(yǎng)組OBs計(jì)數(shù)均高于對照組，且兩組間OBs計(jì)數(shù)有顯著性差異。但在3d時(shí)兩組OBs ALP活性有顯著性差異，5d及7d時(shí)有極顯著性差異，且共培養(yǎng)組OBs ALP活性低于對照組，表明人牙周膜成纖維細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量增加，但抑制其堿性磷酸酶的活性。

ALP是成骨樣細(xì)胞早期分化的重要標(biāo)志之一，其活性高低可反映相應(yīng)組織細(xì)胞的鈣化能力和向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢[7]。牙周膜成纖維細(xì)胞抑制成骨細(xì)胞的作用在體內(nèi)表現(xiàn)為牙周膜結(jié)構(gòu)寬度的保持及發(fā)育期顱骨骨縫的維持中[6]。其機(jī)制可能是牙周膜成纖維細(xì)胞分泌的前列腺素(prostaglandins，PG)等物質(zhì)抑制了成骨細(xì)胞的成骨作用，用環(huán)加樣酶抑制劑吲哚美辛、前列腺素(PG)和前列腺素F2(PGF2)抗體可降低其影響[8]。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)人牙周膜成纖維細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量增加，但抑制其堿性磷酸酶的活性，為深入探討正畸牙齒移動的生物學(xué)機(jī)制以及牙周膜形成和再生的相關(guān)因素奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床正畸治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Hoshi N,Negishi H,Okada S,et al.Response of human fibroblasts to implant surface coated with titanium dioxide photocatalytic films[J].J ProsthodontRes,2010,54(4)：185-191

[2]Jonsson D,NebelD,BratthallG,etal.The human periodontal ligament cell：a fibroblast-like cell acting as an immunecell[J].JPeriodontal Res,2011,46(2)：153-157

[3]Kasaj A,Willershausen B,Reichert C,et al.Ability of nanocrystalline hydroxyapatite paste to promote human periodontal ligament cell proliferation[J].J Oral Sci,2008,50(3)：279-285

[4]Ding C,Cai Y,Marroquin J,et al.Plasmacytoid dendritic cellsregulateautoreactiveB cell activation via solublefactors and in a cell-to-cell contact manner[J].J Immunol,2009,183(11)：7140-7149

[5]Bernhardt A,Thieme S,Domaschke H,et al.Crosstalk of osteoblast and osteoclast precursorson mineralized collagen--towardsan in vitro model for boneremodeling[J].J Biomed Mater ResA,2010,95(3)：848-856

[6]Docheva D,Padula D,Popov C,et al.Establishment of immortalized periodontal ligament progenitor cell line and its behavioural analysis on smooth and rough titanium surface[J].Eur Cell Mater,2010,19(5)：228-241

[7]賀慧霞，劉洪臣，郭宏等.牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化實(shí)驗(yàn)[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，5(9)：129-133

[8]Ghanaati S,Willershausen I,Barbeck M,et al.Tissue reaction to sealing materials：different view at biocom-pat ibility[J].Eur JMed Res,2010,15(11)：483-492