周期性張應(yīng)力對(duì)人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)活性的影響*

劉加強(qiáng) 劉洪臣 房 兵 李 晉

人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblast,hPDLF)對(duì)機(jī)械應(yīng)力的適應(yīng)性改建是正畸牙齒移動(dòng)的生物學(xué)理論基礎(chǔ)。在正畸牙齒移動(dòng)過程中，牙周組織發(fā)生一系列的生理或病理性改變，包括成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活躍[1-2]，各種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的表達(dá)增加，壓力側(cè)牙槽骨吸收，張力側(cè)牙槽骨增生等等[3-5]，最終使牙齒移動(dòng)到新的位置達(dá)到矯治目的。其中牙周膜細(xì)胞活性的變化不僅是促進(jìn)牙周組織改建的重要影響因素，也是影響牙周組織改建后穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的hPDLF，對(duì)細(xì)胞施加不同強(qiáng)度的周期性牽張力，檢測(cè)牽張力作用后hPDLF的總蛋白合成、堿性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)和骨鈣素(OCN)的分泌，探討周期性牽張力對(duì)hPDLF活性的影響。

1.材料與方法

1.1 試劑和儀器 試劑：胎牛血清(Gibco,美國(guó))，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó))，胰蛋白酶(Amresco,美國(guó))，乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco,美國(guó))，TritonX-100(Sigma,美國(guó)),BCA試劑盒(北京賽馳生物公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物公司)，ALP活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)。

儀器設(shè)備 3111型孵箱(ThermoForma，美國(guó))，TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)(安亭,上海)，ELx800uv型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Tek，美國(guó))，溫控超速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó))，TDZS-WS型自動(dòng)平衡高速離心機(jī)(湘儀，湖南)，F(xiàn)V500激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)，DMIL倒置相差顯微鏡(Leica，德國(guó))。

1.2 hPDLF培養(yǎng) 經(jīng)患者同意，取因正畸拔除的11-14歲患者的健康前磨牙，用含有1000U/L雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS緩沖液沖洗后，無菌條件下刮取牙根中部1/3的牙周膜組織并剪成碎片，Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化1小時(shí)，輕輕吹打后離心。棄上清液，細(xì)胞沉淀用經(jīng)DMEM洗滌后平鋪接種于6孔培養(yǎng)板中，加入1.5mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫孵箱(5%CO2、95%空氣、100%濕度、37℃恒溫)中培養(yǎng)。72h后換液，以后隔日換液并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)板底約80%時(shí)傳代，標(biāo)記為第1代。取5-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及其處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔彈性培養(yǎng)板，密度為1×104個(gè)/孔，置于CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后換液去除不貼壁細(xì)胞，然后采用美國(guó)Flexercell細(xì)胞加力裝置對(duì)細(xì)胞施加周期性牽張力，本實(shí)驗(yàn)共分4組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[7-8]，我們分別采用強(qiáng)度為6%、12%、20%細(xì)胞表面拉伸率的周期性牽張力作用于細(xì)胞，頻率為拉伸5s，松弛5s，即6周期/min，作用時(shí)間為24s，并采用不加力組作為對(duì)照，共4組，每組6個(gè)樣本。

1.3.2 周期性牽張力對(duì)hPDLF總蛋白合成的影響 收集各組細(xì)胞，棄去孔內(nèi)液體，用PBS沖洗 3次，每孔加入0.5%的TrtonX-100裂解液150μL過夜后，按蛋白濃度試劑盒說明用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算成總蛋白濃度(ug/mL)。

1.3.3 周期性牽張力對(duì)hPDLF內(nèi)ALP活性的影響 細(xì)胞加力后并裂解后，按ALP試劑盒說明用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP濃度(U/mgprot)。

1.3.4 周期性牽張力對(duì)hPDLF內(nèi)Col-Ⅰ分泌的影響 細(xì)胞加力后，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，按羥脯氨酸試劑盒說明，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，間接反映細(xì)胞Col-Ⅰ活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Col-Ⅰ濃度(ug/mgprot)。

1.3.5 周期性牽張力對(duì)hPDLF內(nèi)OCN分泌的影響 細(xì)胞加力后，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，200μL上清液加入200μL碘(125I)OCN放射免疫分析液和200μL的抗血清并充分混勻，4℃靜置24h，加 1000μL分離劑并混勻，室溫放置20min，4℃離心25min(3500rpm)，吸棄上清，檢測(cè)各組沉淀物中OCN水平(ng/mL)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.結(jié)果

2.1 周期性牽張力對(duì)牙周膜細(xì)胞總蛋白合成的影響 與不加力對(duì)照組相比較，6%的拉伸率對(duì)細(xì)胞總蛋白合成沒有影響(P＞0.05)，12%時(shí)開始下降(P＜0.05)，當(dāng)達(dá)到20%時(shí)，對(duì)蛋白合成出現(xiàn)了顯著的抑制作用(P＜0.01)(表1，圖1)。

表1 各組細(xì)胞總蛋白表達(dá)情況

2.2 周期性牽張力對(duì)牙周膜細(xì)胞ALP活性的影響 6%和12%的拉伸率對(duì)hPDLF的ALP活性無顯著影響(P＞0.05)，當(dāng)力值增至20%時(shí)，開始出現(xiàn)對(duì)ALP活性的抑制作用(P＜0.05)(表2，圖 2)。

2.3 周期性牽張力對(duì)牙周膜細(xì)胞Col-Ⅰ分泌的影響 6%表面拉伸率對(duì)hPDLF的Col-Ⅰ分泌無顯著影響(P＞0.05)，12%-20%拉伸率對(duì)hPDLF的 Col-Ⅰ分泌有抑制作用(P＜0.05)，并呈濃度依賴性(表3，圖3)。

圖1 總蛋白表達(dá)情況

表2 各組細(xì)胞ALP活性

圖2 ALP活性情況

表3 各組細(xì)胞Col-Ⅰ分泌情況

圖3 Col-Ⅰ分泌情況

2.4 周期性牽張力對(duì)牙周膜細(xì)胞OCN分泌的影響 6%和12%的拉伸率對(duì)對(duì)hPDLF的OCN分泌無顯著影響(P＞0.05)，20%的拉伸率對(duì)hPDLF內(nèi)OCN分泌有抑制作用(P＜0.05)(表 4，圖 4)。

表4 各組細(xì)胞OCN分泌情況

圖4 OCN分泌情況

3.討論

牙周組織是人體改建最為活躍的組織之一，這與牙周組織擔(dān)負(fù)咀嚼功能，承載咬合應(yīng)力有關(guān)，牙周膜細(xì)胞活性，特別是在應(yīng)力刺激狀態(tài)下的活性高低直接關(guān)系到牙周組織的適應(yīng)性改建能力以及牙周健康狀況[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中組織塊在培養(yǎng)7-10d后可見周圍有少量細(xì)胞爬出，15d左右可傳代，傳代后的細(xì)胞4-5d就能長(zhǎng)滿瓶底的80%，并且細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，活力較高，純度較高，適合本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究。

hPDLF總蛋白含量的變化能夠反映出細(xì)胞功能的活躍程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，周期性張應(yīng)力可以抑制細(xì)胞總蛋白的合成，并且呈濃度依賴性。但在6%表面拉伸率組，細(xì)胞總蛋白含量無明顯變化，該牽拉強(qiáng)度不足以抑制細(xì)胞蛋白合成。隨著張應(yīng)力強(qiáng)度的進(jìn)一步升高，其抑制蛋白合成的作用開始顯現(xiàn)。周期性張應(yīng)力一方面可以通過抑制細(xì)胞的增殖而使細(xì)胞總量下降，導(dǎo)致總蛋白分泌量下降，另一方面還可通過抑制hPDLF內(nèi)多數(shù)酶的活性，又進(jìn)一步抑制細(xì)胞總蛋白的合成。

ALP是hPDLF分化時(shí)分泌的酶，參與hPDLF的分化成熟，ALP活性的高低，能比較客觀地反映hPDLF分化成熟的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著牽張力強(qiáng)度的增加，ALP的活性逐漸降低，并且呈濃度依賴性，說明細(xì)胞的分化能力逐漸減弱，細(xì)胞活性降低。但6%和12%表面拉伸率，都不足以影響ALP的活性。膠原是構(gòu)成牙周膜基質(zhì)的主要成分之一，在維持牙周組織的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和再生方面都起到重要作用。Col-Ⅰ占到骨有機(jī)基質(zhì)90%以上，在細(xì)胞早期即開始分化，并隨著基質(zhì)的成熟而逐漸增加。本研究結(jié)果表明，6%表面拉伸率對(duì)hPDLF的Col-Ⅰ分泌無顯著影響，12%-20%拉伸率可以呈強(qiáng)度依賴性抑制牙周膜細(xì)胞Col-Ⅰ的合成。說明較強(qiáng)的張應(yīng)力能夠破壞牙周組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這可能也是頜創(chuàng)傷的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制之一。

OCN是成骨樣細(xì)胞成熟的特征性標(biāo)志之一，成熟的hPDLF也可少量合成并分泌OCN，OCN釋放到牙周組織中促進(jìn)牙槽骨及牙骨質(zhì)的礦化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6%和12%的拉伸率對(duì)對(duì)hPDLF的OCN分泌無顯著影響，20%的拉伸率對(duì)hPDLF內(nèi)OCN分泌有抑制作用，說明較強(qiáng)的張應(yīng)力也可影響到牙槽骨及牙骨質(zhì)的礦化，甚至導(dǎo)致骨吸收。

綜上所述，周期性張應(yīng)力可以使hPDLF的多項(xiàng)活性指標(biāo)受到明顯抑制[11]，并且多數(shù)呈強(qiáng)度依賴性。但所有指標(biāo)在6%表面拉伸率時(shí)均未受到影響，說明一定強(qiáng)度范圍內(nèi)的張應(yīng)力作用不會(huì)影響到牙周膜細(xì)胞的活性，這也是牙周組織能夠承擔(dān)一定咬合應(yīng)力的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，臨床上合理掌控正畸力值的大小顯得非常重要，恰當(dāng)?shù)恼饔昧Σ粌H能夠使牙齒移動(dòng)，還能保證牙周膜細(xì)胞活性，促進(jìn)牙周組織改建以及正畸療效的穩(wěn)定

[1]Proff P,R?mer P.The molecular mechanism behind bone remodelling：a review[J].Clin Oral Investig,2009,13(4)：355-362

[2]Xie R,Kuijpers-Jagtman AM,Maltha JC.Osteoclast differentiation and recruitmentduring early stages of experimental tooth movement in rats[J].Eur J Oral Sci,2009,117(1)：43-50

[3]Olson C,Uribe F,Kalajzic Z,et al.Orthodontic tooth movement causes decreased promoter expression of collagen type 1,bone sialoprotein and alpha-smooth muscle actin in the periodontal ligament[J].Orthod Craniofac Res，2012,15(1)：52-61

[4]Monnouchi S,Maeda H,Fujii S,et al.The roles of angiotensin II in stretched periodontal ligament cells[J].J Dent Res,2011,90(2)：181-185

[5]Wasilewska A,Rybi-Szuminska AA,Zoch-Zwierz W.Serum osteoprotegrin(OPG)and receptor activator of nuclear factor kappaB(RANKL)in healthy children and adolescents[J].JPediatr Endocrinol Metab,2009,22(12)：1099-1104

[6]劉加強(qiáng)，劉洪臣，馮 元，等，Caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高糖引發(fā)牙周膜細(xì)胞凋亡中的作用[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011,9(1)：3-6

[7]Jiaqiang Liu,Yi Wang,Xiao Yuan,et.al.Cyclic-stretch inducestheapoptosisof myoblast by activation of Caspase-3 protease in a magnitude-dependent manner[J].Int J Biochem Cell Biol,2010，42(12)：2004-11

[8]Jiaqiang Liu,Jing Liu,Xiao Yuan,et.al.Caspase-3 Mediated CyclicCtretch-Induced Myoblast ApoptosisVia a Fas/FasL-independent Signaling Pathway During Myogenesis[J].Journal of Cellular Biochemistry,2009,107(4)：834-844

[9]劉洪臣,布靜秋.老年人常見的口腔疾病[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2008,6(4)：I0017-I0019

[10]Saito M,Tsuji T.Extracellular matrix administration as a potentialtherapeutic strategy for periodontalligament regeneration[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12(3)：299-309

[11]Ritter N,Mussig E,Steinberg T,et al.Elevated expression of genesassigned to NF-kappaB and apoptotic pathwaysin human periodontal ligament fibroblasts following mechanical stretch[J].Cell Tissue Res,2007,328(3)：537-548