黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠TGF-β1表達的實驗研究*

傅曉駿 熊榮兵

（浙江省金華市中醫(yī)院，浙江 金華 321017）

黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠TGF-β1表達的實驗研究*

傅曉駿△熊榮兵

（浙江省金華市中醫(yī)院，浙江 金華 321017）

目的 研究黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠TGF-β1表達的影響，探討其在糖尿病腎病大鼠腎臟的保護機制。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)加STZ腹腔注射制作糖尿病腎病大鼠模型。分為正常對照組、模型對照組、中藥治療組（黃芪水蛭制劑）、雷公藤治療組（雷公藤）、西藥治療組（洛汀新）、中西藥治療組（黃芪水蛭制劑加洛汀新），觀察各組大鼠治療后血糖變化，并于實驗結(jié)束前進行留尿，測24 h尿蛋白定量。免疫組化方法測定大鼠TGF-β1的表達。結(jié)果 經(jīng)黃芪水蛭制劑治療2個月后，各治療組空腹血糖、24 h尿蛋白定量均明顯低于模型對照組。模型對照組TGF-β1表達顯著高于各治療組。結(jié)論 黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠的腎保護作用可能與其抑制TGF-β1表達有關(guān)。

黃芪水蛭制劑 糖尿病腎病大鼠 TGF-β1雷公藤

△通信作者

Experimental study of Huangqi Shuizhi Preparation on Expression of TGF-β1of Renal Tissue in STZ-in-

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，常常發(fā)展為終末期腎功能衰竭，是影響糖尿病腎病患者生存質(zhì)量和死亡率的重要因素之一。近年來研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）在DN發(fā)病機制中占有重要地位［1］，它能直接引起腎臟多種細胞肥大、ECM過度積聚、腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化等DN特征性病理改變，有學(xué)者認為其可能為DN發(fā)病機制的最后共同通路。本實驗就通過觀察黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠腎組織TGF-β1表達的影響，通過與洛汀新、雷公藤的比較，探討黃芪水蛭制劑對糖尿病腎臟病變的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠 80只，體質(zhì)量（140±20）g，動物許可證號：SYSK（滬）-2009-0069。

1.2 試藥 黃芪水蛭制劑方組成：黃芪、水蛭粉。藥物經(jīng)常規(guī)煎煮過濾，濃縮至每毫升含生藥2.33 g。洛汀新（鹽酸貝那普利片，產(chǎn)品批號：X1377）。雷公藤多苷片 （雷公藤配方顆粒，批號0903136）。鏈尿佐菌素（STZ），美國Sigma公司生產(chǎn)。兔抗TGF-β1多克隆抗體試劑盒，Abcam公司生產(chǎn)。24 h尿蛋白定量試劑盒，由南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)。血糖試紙，強生公司生產(chǎn)。

1.3 分組及造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機取8只為正常對照組，其余為模型組。模型組予高脂飼料喂養(yǎng)，按文獻方法腹腔注射STZ，每周1次，連續(xù)3周，造模完成72 h后，經(jīng)尾靜脈采血測血糖，空腹血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型復(fù)制成功。1周后留取大鼠即刻尿，測尿微量白蛋白及尿肌酐，模型組的尿微量白蛋白/尿肌酐顯著高于正常對照組，即為糖尿病腎病造模成功。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型對照組、中藥治療組、雷公藤治療組、西藥治療組、中西藥治療組，每組8只。

1.4 治療方法 正常對照組、模型對照組分別予以2 mL的蒸餾水灌胃，中藥治療組予黃芪水蛭制劑煎液 （每毫升含生藥量2.33 g）2 mL灌胃，西藥治療組予洛汀新（蒸餾水溶解，每毫升含洛汀新0.33 mg）2 mL，中西藥治療組予黃芪水蛭制劑煎液加洛汀新（蒸餾水溶解每毫升含生藥量2.33 g，含洛汀新量0.33 mg）混懸液2 mL灌胃，雷公藤組予雷公藤配方顆粒（蒸餾水溶解，每毫升含雷公藤33.3 mg）2 mL灌胃，連續(xù)給藥2個月。實驗期間各組大鼠自由攝食、飲水。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 （1）24 h尿蛋白定量。動物灌胃2個月后，即實驗結(jié)束前1 d，金屬代謝籠收集大鼠的即刻尿及24 h尿液，-70℃冰箱保存，待測。24 h尿蛋白定量即嚴格按照說明書操作完成，由上海曙光醫(yī)院腎病研究所里測定。（2）空腹血糖。開始用藥前及治療結(jié)束后，尾靜脈采血，用血糖儀及血糖試紙測定隨機血糖，用強生血糖儀進行測定。（3）腎臟組織中TGF-β1的表達。實驗結(jié)束后處死大鼠，無菌操作取腎，去掉包膜，矢狀線正中切開，1/2腎臟用10%甲醛溶液固定，取小塊皮質(zhì)，脫水包埋，行石蠟塊4 μm厚連續(xù)切片。采用SP法，按照TGF-β1試劑盒操作程序進行免疫組織化學(xué)染色。光鏡下觀察胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。用IPP6.0圖像分析軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組空腹血糖含量比較 統(tǒng)計治療后各組大鼠空腹血糖的變化結(jié)果見表1。與模型組比較，各治療組空腹血糖均明顯下降（P＜0.05），但各治療組之間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組空腹血糖、24 h尿蛋白定量比較（±s）

表1 各組空腹血糖、24 h尿蛋白定量比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05。

組 別 n 空腹血糖（mmol/L） 24 h尿蛋白定量（mg/L）正常對照組 8 7.2500±0.94567* 13.005956±3.7180283*模型對照組 8 32.3750±1.25670 91.770421±14.3294954中藥治療組 8 24.5857±1.98026* 53.419090±24.3501670*西藥治療組 8 26.1000±3.51454* 54.095916±22.1365442*雷公藤治療組 8 25.5857±1.68026* 50.419090±23.3501670*中西藥治療組 8 23.3250±5.62437* 38.338335±14.1844041*

2.2 各組24 h尿蛋白定量比較 治療后各組大鼠24 h尿蛋白定量見表1。模型對照組顯著高于正常對照組（P＜0.05）；與模型對照組比較，各治療組均呈明顯下降趨勢（P＜0.05），但各治療組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 TGF-β1在大鼠腎組織中的表達 正常對照組大鼠呈弱陽性的表達或沒有表達，而與正常對照組相比，模型對照組明顯呈強陽性的表達，各治療組也均有表達，但與模型組比較，表達弱些，呈下降趨勢。見圖1。

圖1 各組腎臟組織切片

3 討 論

DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”、“水腫”等范疇。其病機為本虛標(biāo)實之證，氣陰兩虛為其本，瘀血阻絡(luò)為其標(biāo)。筆者認為益氣養(yǎng)陰、活血化瘀法為早期糖尿病腎病治療大法。具體應(yīng)用黃芪水蛭制劑治療。方中黃芪味甘性微溫，歸脾肺經(jīng)，既能補脾氣而升陽，又能補益肺脾氣而固表利水，具有補氣升陽，水消腫之功。藥理研究顯示，黃芪能降糖、改善微循環(huán)，抗血小板和紅細胞聚集，降低血黏度，有利于減輕脂質(zhì)在腎小球的沉積和清除過氧化物，促進腎小球基底膜的修復(fù)，顯著減少尿蛋白的排泄［2］。而水蛭是一種傳統(tǒng)的破血藥，微寒咸腥，善破血瘀，通經(jīng)脈，利水道。藥理研究也表明：水蛭含水蛭素、組胺樣物質(zhì)、肝素、抗血栓素，能阻礙血液凝固，擴張血管，促進血液循環(huán)，并有降低動物血清TC、TG，調(diào)整前列腺素I2/血栓素B2比值，從而起到使動脈斑塊消退的作用［3］。

糖尿病腎病主要病變是腎小球出現(xiàn)以細胞外基質(zhì)增多為主要特征的系膜區(qū)增寬、基底膜增厚，隨病情進展可繼發(fā)腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管基底膜增厚、腎間質(zhì)單個核細胞浸潤及晚期時腎間質(zhì)纖維化等間質(zhì)病變［4］。除了血糖、血脂代謝紊亂、血液動力學(xué)異常，許多實驗和臨床資料均提示糖尿病往往存在炎細胞浸潤和細胞因子、炎癥介質(zhì)水平上升［5-6］。TGF的高表達，可通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路使MCP-1基因上調(diào)及轉(zhuǎn)錄增強，因此TGF與MCP-1通過直接或間接的方式相互作用，造成惡性循環(huán)，加重了DN的炎癥反應(yīng)，促進了DN的進展。TGF-β1是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的細胞外基質(zhì)沉積促進劑，能作用于多個環(huán)節(jié)，能刺激各種細胞外基質(zhì)成分的合成和沉積，抑制蛋白水解酶的產(chǎn)生，使細胞外基質(zhì)沉積進一步增加。因此TGF-β1已被公認為導(dǎo)致細胞外基質(zhì)積聚的重要生長因子，并且和腎組織硬化密切相關(guān)。因而抑制TGF-β1在腎臟的過度表達或阻斷其作用是防治或延緩DN發(fā)生發(fā)展的一條有效途徑［7-8］。

本實驗顯示，黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠有一定的治療效果，具有一定的腎臟保護作用。黃芪水蛭制劑與雷公藤組比較，雖然沒有明顯的差異，但與雷公藤效果非常接近，有關(guān)研究表明雷公藤多苷片可能通過影響TGF-β1在DN腎組織內(nèi)的表達而發(fā)揮保護腎小管損害的作用，也可能是雷公藤多苷片保護DN腎臟足細胞、抑制系膜增殖甚至減輕腎小球微血管病變的機制之一［9］。與模型組比較，經(jīng)治療2個月后黃芪水蛭制劑組的腎組織的TGF-β1表達明顯受到抑制。TGF-β1參與了腎臟病理變化，抑制TGF-β1的表達可以延緩糖尿病腎臟的損害，這與文獻報道一致［10］。隨著TGF-β1表達的下調(diào)，蛋白尿明顯減少及腎功能得以改善，說明TGF-β1表達的下調(diào)與蛋白尿減少、腎組織病理腎功能改善密切相關(guān)，推測黃芪水蛭制劑可能通過抑制DN大鼠炎癥反應(yīng)，減少了蛋白尿的發(fā)生，延緩了腎功能損害進展。

綜上所述，黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠具有改善腎功能的作用，其機制可能與其抑制TGF-β1表達，抑制了DN大鼠炎癥反應(yīng)，減少蛋白尿的發(fā)生有關(guān)。

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duced Diabetic Nephropathy Rats

FU Xiao-jun，XIONG Rong-bing.TCM Hospital Of Jinhua City，Zhejiang Province， Zhejiang，Jinhua，321017

Objective:To investigate the effect of Huangqi shuizhi Preparation on expression of TGF-β1 of renal tissue in STZ-induced diabetic nephropathy rats,and further explore the mechanism of action of Huangqi shuizhi Preparation on the renal protection in STZ-induced Diabetic Nephropathy Rats.Methods:Fed with high fat diet and STZ produced by intraperitoneal injection in rats with diabetic nephropathy.Rats were randomly divided into six groups:normal control group，model control group，Chinese medicine group （Huangqi shuizhi Preparation group），Leigongtengpian Duo DAI pian group,western medicine group （Lotensin group）and Chinese and Western medicine group （Huangqi shuizhi Preparation and Lotensin group）.Rats were determined after treatment fasting blood glucose.Leave all rats's urine before the end of the experiment.And the 24 hurinary protein was determined.The expression of TGF-β1of renal tissue in STZ-induced diabetic nephropathy rats was measured with immunohistochemical method.Results:After treatment for two months with renal sugar granule,the general situation in rats compared with the model rats were improved better;and the weight also gain significantly.Fasting blood glucose，24h urinary protein in the treatment groups were significantly lower than the model group;and TGF-β1 of Renal Tissue in the model rats showed high expression,respectively significantly higher than every treatment groups.Conclusion:The possible mechanism of the renal protective effect of Leigongtengpian Duo DAI pian on STZ-induced Diabetic Nephropathy Rats is the inhibited expression of TGF-β1in renal tissue in rats.

Huangqishuizhi Preparation；Diabetic nephropathy in rats；TGF-β1；Leigongteng

R285.5

A

1004-745X（2012）10-1595-03

浙江省中醫(yī)藥管理局立項課題（2010ZB155）

2012-05-08）