食品中3種致病菌快速檢測方法的研究進(jìn)展

夏慧麗

（臺州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 臺州 318000）

食品中3種致病菌快速檢測方法的研究進(jìn)展

夏慧麗

（臺州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，浙江 臺州 318000）

總結(jié)食品中沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌3種致病菌的快速檢測方法。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測耗時(shí)繁瑣，不能滿足當(dāng)今發(fā)展的需求。目前采用的PCR、ELISA、核酸雜交、生物傳感器等分子生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)，檢測周期短、精確度高、特異性和敏感性好等，這些方法聯(lián)用能達(dá)到更好的檢測效果。

沙門氏菌；副溶血性弧菌；單核細(xì)胞增生李斯特菌；快速檢測

隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，食品、海產(chǎn)品中存在的衛(wèi)生隱患問題也愈發(fā)嚴(yán)重。沙門氏菌（Salmonellatypli，ST）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是常見的重要食源性致病菌，它們廣泛分布在河口、海水及沉積物、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域，寄生在海洋生物體中[1]，通過污染的動物源性食品感染人類，導(dǎo)致食物中毒，嚴(yán)重危害人體健康。在我國現(xiàn)行國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，這3種菌被列為致病菌的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。

目前我國食品中致病菌的檢驗(yàn)普遍采用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法（如細(xì)菌分離培養(yǎng)等）和血清學(xué)方法，這些方法一般都繁瑣、費(fèi)時(shí)，大致需要4 d～6 d才能出檢驗(yàn)結(jié)果，且檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度不高。因此，建立一些快速、準(zhǔn)確度高的檢驗(yàn)食品中致病菌的方法已成為我國食品監(jiān)管部門的當(dāng)務(wù)之急。本文總結(jié)了目前一些檢測食品中沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速方法，以期使食品檢驗(yàn)工作者了解和掌握更多的食源性致病菌的先進(jìn)檢測技術(shù)、加快檢測工作的進(jìn)行。

1 副溶血性弧菌（VP）快速檢測方法

副溶血性弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽的多形態(tài)細(xì)菌，廣泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品中，是引起急性胃腸炎的重要病原菌之一[2]。

1.1 KP溶血實(shí)驗(yàn)

副溶血性弧菌臨床分離株絕大部分都能產(chǎn)生耐熱直接溶血毒素（TDH），并能在莪萋氏血平板上產(chǎn)生一種特殊的溶血現(xiàn)象,即神奈川現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)在經(jīng)過前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)后，挑取可疑菌落接種到莪萋氏血平板上，置于37℃孵箱過夜，如菌苔周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)，即為KP陽性，表明樣本中含有VP。該試驗(yàn)是檢測副溶血性弧菌最基本的方法,能把絕大部分副溶血性弧菌檢測出來，但操作繁瑣、所需時(shí)間長（約4 d），而且存在部分TDH-株，易漏檢[3]。

1.2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法中現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的是酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）。該方法從抗體的包被到酶聯(lián)顯色，都已經(jīng)具備了成熟的技術(shù)，易于制備試劑盒，操作簡單，特異性好，靈敏度高。但此反應(yīng)只能大概區(qū)分不同地區(qū)和來源的菌株,而且由于抗原位點(diǎn)受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變,出現(xiàn)新的血清型時(shí),以現(xiàn)有的血清檢測就會漏檢。臧紅梅等[4]采用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Dot－ELISA）技術(shù)檢測副溶血弧菌，根據(jù)棋盤試驗(yàn)確定副溶血弧菌，以出現(xiàn)明顯清晰斑點(diǎn)者判定為陽性。

1.3 核酸雜交

免疫學(xué)方法是在蛋白水平檢測VP，而核酸雜交則是在基因水平進(jìn)行檢測，結(jié)果更為特異、準(zhǔn)確、可靠。用于檢測VP的核酸雜交方法主要有斑點(diǎn)雜交[5]、Southern雜交[6]、夾心法雜交[7]。洪幫興等[8]利用帶正電荷尼龍膜為芯片載體,合成寡核苷酸探針,點(diǎn)樣于載體制成寡核苷酸芯片,對食源性感染常見致病菌23SrDNA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測。VP等10種（屬）菌雜交結(jié)果顯示出很好的靈敏度和特異性，檢出水平可達(dá)10 cfu/mL。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

近年來,隨著微生物基因組學(xué)的發(fā)展,微生物基因檢測迎來了新的機(jī)遇。根據(jù)VP的特異基因序列,設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測，是現(xiàn)階段檢測VP的最快速準(zhǔn)確的方法。目前PCR方法主要有任意引物PCR（Ap－PCR）、針對任意引物 PCR、多重 PCR（multiplex－PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real－time PCR）。如 Venkateswaran 等[9]選擇gyrB基因設(shè)計(jì)引物對VP進(jìn)行PCR，Cordova等[10]選擇pR72H基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，特異性、靈敏度都很好。與其他常規(guī)生化方法相比，多重PCR更快速，僅8 h就能完成檢測，結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠，而且還可改進(jìn)成定量競爭PCR，對標(biāo)本中靶序列進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)PCR操作簡單，閉管檢測，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過程進(jìn)行同步定性或定量檢測，而且可以進(jìn)行臨床大規(guī)?？焖贆z測。

1.5 瓊脂糖和納米金材料檢測

瓊脂糖和納米金材料檢測是近兩年流行的一種初步用于副溶血性弧菌的快速篩檢技術(shù)，其技術(shù)關(guān)鍵是制備免疫電極。趙廣英等[11]將HRP-anti-VP摻雜于瓊脂糖和納米金中并修飾于絲網(wǎng)印刷電極表面，從而制備副溶血性弧菌免疫電極，采用循環(huán)伏安法表征免疫電極和監(jiān)測酶促反應(yīng)，根據(jù)還原電流的變化來定量測定副溶血性弧菌。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，免疫電極線性檢測范圍為105cfu/mL～109cfu/mL，檢出限為7.4×104cfu/mL（S/N=3）。

2 單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM）快速檢測方法

單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM）是食品衛(wèi)生中的重要病原菌，多通過食品經(jīng)口感染，被列為20世紀(jì)90年代食品中的四大病原菌之一。過去對食品中LM進(jìn)行檢測時(shí)，克隆培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法需要3周～4周的時(shí)間才能得出結(jié)果?，F(xiàn)在采用的方法為常溫培養(yǎng)法，但仍需7 d～11 d才能分離鑒定出來。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法人力物力花費(fèi)很大，已不能滿足現(xiàn)實(shí)需要。自1985年以來，免疫分析、分子生物學(xué)技術(shù)用于此菌的檢驗(yàn)，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了靈敏度?，F(xiàn)就相關(guān)的檢測技術(shù)作一簡單介紹，為深入研究提供參考。

2.1 免疫學(xué)方法ELISA

1992年Bhunia等[12]利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)建立的夾心ELISA方法，能于20h～24h內(nèi)檢測出8cfu/g～10 cfu/g（mL）的樣品?，F(xiàn)在已有單增李斯特菌檢測試劑盒可供使用，用ELISA方法操作較簡單，特異性強(qiáng)，反應(yīng)靈敏度高，但單克隆抗體制備昂貴，檢測費(fèi)用較高[13]。

2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

楊百亮等[14]通過條件優(yōu)化，建立了快速檢測牛奶中單核細(xì)胞增生李斯特菌的試劑盒，并在同年用PCR對市售豬肉和牛奶中的單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測[15]。姜永強(qiáng)[16]人工感染牛奶經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后PCR檢測，可達(dá)到600 cfu/mL～6000 cfu/mL牛奶的敏感度。

熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)巧妙地利用了PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增的高效性，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性以及計(jì)量高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又克服了普通PCR技術(shù)易污染，不能定量，探針雜交靈敏度不高，分離洗脫條件不易控制等不足，在疾病的基因診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景[17]。金大智等[18]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR（Realtime PCR）技術(shù)建立對食品中單增李氏菌進(jìn)行檢測的快速方法，設(shè)計(jì)的引物和探針的序列特異性強(qiáng)，省去凝膠電泳的繁瑣，降低了污染的可能性。

2.3 基因探針

Volokhov等[19]以李斯特的6種毒力蛋白基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)多重PCR，研制出了基因芯片檢測單增李斯特菌。核酸探針技術(shù)，雖較常規(guī)方法具有更多的優(yōu)點(diǎn)，但還存在著諸如同位素標(biāo)記探針的放射性污染、檢測步驟復(fù)雜，耗時(shí)長等不足，并且缺乏環(huán)境監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查所必需的敏感性。

2.4 膠體金試紙快速檢測

崔煥忠[20]制備單增李斯特菌（LM）特異性單克隆抗體，研制膠體金試紙，快速檢測食品中LM。對LM純培養(yǎng)物檢測的靈敏度為3.9×105cfu/mL；4℃保質(zhì)期在120 d以上；對自來水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷凍蝦仁和面包模擬樣品檢測的靈敏度為3.9×105cfu/mL。該試紙具有快速、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，可用于食品中LM的快速檢測。

3 沙門氏菌（ST）快速檢測方法

在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第2位，我國細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由它引起的。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法是采集糞便和血液標(biāo)本做細(xì)菌培養(yǎng)，然后做生化和血清學(xué)鑒定，檢驗(yàn)程序復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，難以應(yīng)對突發(fā)事件的發(fā)生。因此，建立一種快速而準(zhǔn)確的方法一直是沙門氏菌檢測研究的核心問題。為了尋求快速、準(zhǔn)確、簡便、微量的檢測方法，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法。

3.1 免疫學(xué)方法

3.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELLISA）

ELLISA法是將細(xì)菌經(jīng)離心之后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，然后放在多孔板中固定，加抗鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛抗體作用，再加第二酶標(biāo)抗體作尉，最后以底物顯色，產(chǎn)棕色或蘭色為陽性。這種方法最小檢出量可達(dá)104cfu/mL～105cfu/mL，其缺點(diǎn)是會引起假陽性反應(yīng)。

許多學(xué)者把其他方法與免疫學(xué)方法結(jié)合起來以提高檢測靈敏性，大大縮短了樣品檢測周期[21]。如酶聯(lián)免疫吸附法與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合，用直接ELISA篩檢優(yōu)先去除假陰性樣品，再采用PCR法檢測提高檢測速度。如黃金琳等[22]直接ELISA法的敏感性和特異性達(dá)100%和97.2%，PCR法的敏感性和特異性均為100%。

3.1.2 免疫熒光標(biāo)記

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。Cloak等[23]利用表面吸附將檢測樣品吸附于玻璃載片表面的一種薄膜上，然后用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判定。該方法檢測限為103cfu/mL個(gè)沙門氏菌，且不呈現(xiàn)假陰性與假陽性反應(yīng)。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

作為分子生物學(xué)方法，PCR法具有快速、簡便、靈敏的特點(diǎn)，是檢測沙門氏菌的發(fā)展方向。由于PCR是一種極為靈敏的反應(yīng)，一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性。

3.2.1 常規(guī)PCR

劉勝貴等[24]根據(jù)自行設(shè)計(jì)的引物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物是沙門氏菌phoP基因的662 bp的DNA片段。邵碧英等[25]利用沙門氏菌的多個(gè)靶基因 invA、hilA、hut、hns建立多重PCR檢測，提高了其檢出率并同時(shí)鑒定其血清型及突變等，降低了檢測時(shí)間。

3.2.2 RT-PCR（Real-Time PCR）

沙門氏菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測技術(shù)保留了常規(guī)PCR檢測的特異性和敏感性，可同步完成多個(gè)樣品的擴(kuò)增及定量，適宜于大批樣品的檢測處理，極大地提高了檢測效率。Burkhard等[26]以腸炎沙門氏菌特異性invA基因序列為模板，通過RT-PCR檢測樣品，均為陽性。

3.2.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，同時(shí)檢測幾個(gè)項(xiàng)目。鐘偉軍等[27]建立的熒光定量PCR方法對多種細(xì)菌進(jìn)行檢測，所有沙門氏菌的檢測結(jié)果均為陽性，其它非沙門氏菌的檢測結(jié)果為陰性。

3.3 快速熒光法檢測

選用帶有熒光信號的物質(zhì)作為指示物，此方法操作方便，敏感性和特異性好，如用4-甲基傘形酮辛脂（4－Methyl-umbelliferyl-caprylate，MUCAP）試劑作為熒光信號檢測。褚天新等[28]在未知標(biāo)本的檢測中發(fā)現(xiàn)MUCAP試驗(yàn)沙門氏菌陽性檢出率為常規(guī)法的96.07%，相比傳統(tǒng)方法，可節(jié)約鑒定時(shí)間12 h～24 h，是一種高靈敏度和特異性的沙門氏菌快速篩檢方法。

3.4 核酸探針

核酸探針技術(shù)雖為一種快速、敏感、特異的檢測新技術(shù)，但其在實(shí)際應(yīng)用中仍存在不少問題。放射性同位素標(biāo)記的核酸探針具有半衰期短、對人體有危害等缺點(diǎn)，作為常規(guī)診斷，特別是在食品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室很不適用。核酸探針技術(shù)在檢測食品中其他致病菌及產(chǎn)毒素菌等方面也有廣泛的應(yīng)用[29]。

3.5 SPR生物傳感器的應(yīng)用

根據(jù)SPR生物傳感器實(shí)時(shí)檢測和高靈敏度的特點(diǎn)與沙門氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病原菌的快速檢測。Bergwerff等[30]使用SPR生物傳感器的檢測限為107cfu/mL，有100%的特異性，但是SPR生物傳感器在國內(nèi)應(yīng)用還是很少，有待進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)

沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的分離培養(yǎng)方法對于需要檢測大量樣本的食品、衛(wèi)生以及獸醫(yī)部門的實(shí)驗(yàn)室是一種沉重的負(fù)擔(dān)，快速檢測方法除帶來檢驗(yàn)工作本身的革新外，更重要的是由此而產(chǎn)生的社會效益，如減少食品庫存費(fèi)用、污染等問題得以盡快處理。

目前3種菌的快速檢測研究主要集中在PCR、核酸雜交、免疫熒光、酶聯(lián)免疫ELISA等方法上，但單純每一種方法均存在很多缺點(diǎn)。如酶聯(lián)免疫吸附法能避免假陰性，但靈敏度和特異性又不及PCR；常規(guī)的PCR方法雖然符合快速簡便等要求，但是它易污染，假陽性高。相比之下，RT-PCR不僅克服了PCR的缺點(diǎn)，而且具有操作簡單、結(jié)果直觀、可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高；探針實(shí)驗(yàn)存在基因污染等弊端。因此，要使快速檢驗(yàn)技術(shù)廣泛應(yīng)用，擴(kuò)大其檢驗(yàn)適用范圍，克服假陽性和假陰性反應(yīng)，考慮生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用的可能性和潛在的公共衛(wèi)生等問題，實(shí)現(xiàn)相互間的聯(lián)用技術(shù)是十分必要的。

應(yīng)該指出的是，快速檢測方法的應(yīng)用并不意味著完全拋棄分離培養(yǎng)方法。在某些情況下，特別是涉及一些需要最終結(jié)果的樣品時(shí)，分離培養(yǎng)方法還是必不可少的。

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Advance in Rapid Detection Study on Three Pathogenic Bacterias in Food

XIA Hui-li
（Research Institute of Quality&Technical Supervision and Inspection,Taizhou 318000,Zhejiang,China）

The development of method for the rapid detection of salmonella typli,vibrio parahae molyticus and listeria monocy to genes in food were reviewed in this paper.The traditional bacteriology detections have not been satisfied the requirement of development because of time-consuming.The current rapid detections,such as PCR,ELISA,nucleic acids hybrid,biosensor and immunology technology,were efficient,precise,highly specificity and sensitivity.At last we prospected the direction of development and perspective of the methods for detection of the three pathogenic bacteria in the future.

salmonella typli;vibrio parahae molyticus;listeria monocytogenes;rapid detection

浙江省質(zhì)監(jiān)系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（20090237）

夏慧麗（1978—），女（漢），高級工程師，博士，研究方向：食品檢測與分析。

2011-12-11