真菌毒素檢測技術(shù)研究進(jìn)展

尚艷娥

(國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京 100162)

真菌毒素檢測技術(shù)研究進(jìn)展

尚艷娥

(國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京 100162)

對較為經(jīng)典的真菌毒素檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述，并對近些年研究開發(fā)的一些新技術(shù)和新動態(tài)作了簡要介紹，總結(jié)了真菌毒素檢測領(lǐng)域的發(fā)展趨勢和方向，為食品安全檢測技術(shù)的研究開發(fā)提供一定的參考．

真菌毒素;快速檢測;多組分檢測

真菌毒素是真菌的二次性代謝產(chǎn)物，與真菌本身的生長發(fā)育無關(guān)，并不是所有代謝物都有毒．一種真菌可能產(chǎn)生多種毒素，多種真菌可能產(chǎn)生同一種毒素［1］．危害較大的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和麥角類生物堿等［2］．黃曲霉毒素是天然物中致癌性最強的毒素，也是世界各地的農(nóng)產(chǎn)品及食品最易受其污染的一種真菌毒素，聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計全世界谷物供應(yīng)的25%受真菌毒素污染［3］．這些真菌毒素會通過被污染的谷物、飼料和由這些飼料喂養(yǎng)的動物所提供的動物性食品進(jìn)入我們的食物鏈，從而對人畜表現(xiàn)出致癌性、遺傳毒性、致畸性．作為一級預(yù)防的主要措施，就是制定真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此，準(zhǔn)確檢測真菌毒素含量的技術(shù)手段變得極為重要．

1 真菌毒素常規(guī)檢測技術(shù)

真菌毒素的檢測方法有很多種，比較經(jīng)典且已經(jīng)形成國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)予以實施的檢測方法，主要包括薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等，這些常規(guī)的檢測方法主要是針對某一種真菌毒素進(jìn)行檢測．

1.1 薄層層析法

薄層層析法是在20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種平面色譜技術(shù)，該方法針對不同的樣品，用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑把待檢測的毒素從樣品中提取出來，經(jīng)純化后在薄層板上展開層析、分離，利用真菌毒素的熒光特性，與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性和定量．國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中黃曲霉毒素B1的測定》GB/T 5009.22—2003和《食品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測定》GB/T 5009.23—2006將薄層色譜法作為第一法實施．

該法的優(yōu)點是經(jīng)濟，對設(shè)備和檢驗人員要求不高．特別是隨著高效薄層色譜法以及薄層掃描儀的發(fā)展和應(yīng)用，提高了薄層層析法的分離效率和檢測精確度，由此拓寬了薄層層析法技術(shù)在檢測真菌毒素領(lǐng)域中的應(yīng)用，因此該法目前仍是除北美和歐洲以外其他國家，尤其是發(fā)展中國家檢測食品和飼料中真菌毒素，特別是檢測某些本身能夠發(fā)熒光的毒素的主要檢測方法［4］．

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是目前已經(jīng)比較成熟的免疫學(xué)方法，文獻(xiàn)［5］報道，建立在免疫酶基礎(chǔ)上的一種新型免疫測定技術(shù)．該法建立于抗原抗體高度特異性結(jié)合以及抗原或抗體的酶標(biāo)記基礎(chǔ)之上，具有靈敏、操作簡便、樣品前處理無需凈化(或只需最小限度的凈化)、樣品處理量大的優(yōu)點．但酶聯(lián)免疫吸附法還存在一定的缺點，主要是由于該法需要的抗體抗原制備過程復(fù)雜，技術(shù)難度高。此外，方法的特異性強，只能針對單一毒素的檢測．因此在改進(jìn)樣品的純化步驟，提高回收率和靈敏度，減少本底干擾，提高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，簡化分析程序，降低分析成本等方面都有待于進(jìn)一步發(fā)展［6］．

目前已建立多種分析各類農(nóng)產(chǎn)品和食品中真菌毒素的酶聯(lián)免疫吸附法，國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中黃曲霉毒素B1的測定》GB/T 5009.22—2003將該法定為第二法．國際上檢測糧油食品中多種真菌毒素商品化的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒已被廣泛用于實際工作中．

1.3 免疫親和層析凈化熒光光度法

免疫親和柱凈化法因其快速、準(zhǔn)確的特性，已經(jīng)越來越引起人們的重視．免疫親和柱就是利用真菌毒素特異性抗體制成的一種凈化柱，保證真菌毒素與樣品基質(zhì)的有效分離，降低檢測方法的檢出限，縮短檢測時間，減少溶劑用量［7］．目前我國已建立黃曲霉毒素(GB/T 18979—2003第二法)、赭曲霉毒素A(GB/T 25220—2010第二法)、伏馬毒素(GB/T 25228—2010第二法)等免疫親和柱凈化熒光光度法國家標(biāo)準(zhǔn)．

免疫親和層析凈化熒光光度法最大優(yōu)點在于，利用免疫親和層析柱從粗提液中經(jīng)一次簡單處理便可得到所需高純度活性物質(zhì)，不使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，直接測定樣液熒光強度比較定量，大大減少了對操作人員和環(huán)境的危害，很好地解決了真菌毒素分析檢測中樣品不純問題．該樣品前處理技術(shù)配合HPLC和熒光光度計，在真菌毒素分析檢測中得到廣泛應(yīng)用，但其主要缺點是免疫親和層析柱價格較高，目前還只有幾種真菌毒素有商用免疫親和層析柱，有的樣品上柱前還需先凈化，有時還存在回收率較低問題．

1.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法是定量分析真菌毒素最常用的方法，可實現(xiàn)對毒素定性、定量、確證同時進(jìn)行，其中應(yīng)用最廣的是反相液相色譜．由于真菌毒素性質(zhì)不同，加上分析條件之間相互影響、相互制約，為達(dá)到理想的分離效果，分析時要綜合考慮流動相、色譜柱、柱溫和檢測器等分析條件，找出最佳配比．某些自身產(chǎn)生熒光的真菌毒素如OTA和麥角堿可直接用配有熒光檢測器的HPLC分析，而其他一些分子中不含發(fā)色基團(如伏馬毒素)或本身可產(chǎn)生熒光但強度較弱(如AFB和AFG)的毒素進(jìn)行HPLC分析時需經(jīng)柱前或柱后衍生、改變流動相條件(如使用離子對試劑、改變流動相pH等)以增強熒光信號方能定量檢測［4］．目前我國已建立黃曲霉毒素(GB/T 18979—2003第一法)、赭曲霉毒素A(GB/T 25220—2010第一法)、伏馬毒素(GB/T 25228—2010第一法)等免疫親和柱凈化高效液相色譜法國家標(biāo)準(zhǔn)．

除了這些在國內(nèi)外廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，圍繞這些經(jīng)典方法的改進(jìn)也取得了很大進(jìn)展．如高效薄層色譜采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對吸附劑進(jìn)行疏水和親水改性，可以實現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性;高效薄層色譜還可與其他分離檢測分析技術(shù)聯(lián)用，更有利于化合物的定性鑒別和定量檢測，如薄層色譜-傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用檢測、薄層色譜-拉曼光譜聯(lián)用檢測、薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等［8］;對于單端孢霉烯族化合物而言，氣相色譜法是檢測它們的較好方法，因為它們?nèi)菀谆诹u基的衍生來大大增加其揮發(fā)性和靈敏度．如在AOAC Official Method 986.18中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定方法使用的就是氣相色譜法［9］．

2 真菌毒素快速篩選檢測技術(shù)

從目前食品安全發(fā)展趨勢來看，準(zhǔn)確、省時、省力和省成本的快速檢測技術(shù)，是政府管理部門、食品生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)、銷售企業(yè)等各方面都迫切需要的控制手段，也是制約食品安全監(jiān)管的一個瓶頸．因此，建立簡便、高效、低成本的現(xiàn)場快速篩選檢測方法是食品安全領(lǐng)域的一項急迫而重要的研究內(nèi)容．近年來，真菌毒素現(xiàn)場快速篩選檢測技術(shù)取得的進(jìn)展主要在免疫膠體金層析技術(shù)和近紅外無損傷檢測技術(shù)的應(yīng)用這兩個方面．

2.1 免疫膠體金層析技術(shù)

膠體金用于免疫學(xué)檢測研究是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于特異性抗原抗體反應(yīng)．免疫膠體金層析快速診斷試紙條是20世紀(jì)90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用．該技術(shù)主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在醋酸纖維素膜上，膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待測物和金標(biāo)試劑的復(fù)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可目測的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果．而流離標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離的目的［10］．

該項技術(shù)應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的檢測才剛剛起步．2005年，賴衛(wèi)華等［11］利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理研制了免疫膠體金技術(shù)檢測赭曲霉毒素A的試紙條;2006年，孫秀蘭等［12］研究了黃曲霉毒素B1金標(biāo)記免疫檢測體系建立過程中的影響因素;2007年，鄧省亮等［13］利用膠體金免疫層析技術(shù)建立了一種快速檢測食品中黃曲霉毒素B1的方法．這些試紙條整個過程只需一步加樣，一般15 min內(nèi)就能判定結(jié)果，非常適合于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測，容易被基層掌握并大面積推廣，適應(yīng)我國經(jīng)濟技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r．

2.2 近紅外檢測技術(shù)

近紅外(near infrared，NIR)光是指波長介于可見光與中紅外區(qū)之間的電磁波，波長范圍是700～2 500 nm．自20世紀(jì)50年代起，隨著商品化儀器的出現(xiàn)及近紅外光譜和多元線性回歸分析應(yīng)用于測定谷物中水分、蛋白質(zhì)、脂肪的成功，近紅外檢測技術(shù)在農(nóng)副產(chǎn)品分析中得到廣泛應(yīng)用，大大推動了近紅外技術(shù)的應(yīng)用．近紅外光譜以其分析速度快、效率高、成本低、樣品預(yù)處理簡單、測試重現(xiàn)性好、便于實現(xiàn)在線分析、典型的無損分析技術(shù)等特點已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域．特別是在歐、美及日本等發(fā)達(dá)國家，很多近紅外光譜分析法被列為標(biāo)準(zhǔn)方法［14］．我國也制定了稻谷、小麥、玉米中水分、粗蛋白質(zhì)、脂肪等含量的近紅外測定系列方法(GB/T 24896—2010至GB/T 24902—2010)．

在真菌毒素檢測方面，Dowell等用近紅外分析了發(fā)霉小麥中的嘔吐毒素，結(jié)果表明嘔吐毒素能很好地被近紅外測量和預(yù)測;Berardo等發(fā)現(xiàn)近紅外技術(shù)可以較好地檢測發(fā)霉玉米籽粒中的伏馬毒素;文獻(xiàn)［14］報道，應(yīng)用近紅外檢測技術(shù)建立模型分析高羊茅中由內(nèi)生真菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)麥角生物堿的含量，有效提高了麥角生物堿檢測速度．

3 真菌毒素多組分協(xié)同檢測技術(shù)

現(xiàn)有的傳統(tǒng)真菌毒素檢測方法大多是針對某一種毒素的檢測，檢測效率低，而且成本普遍較高，因此，發(fā)展能同時檢測多種毒素的檢測方法是未來的發(fā)展方向．

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

近幾年，很多研究人員將研究目標(biāo)放在多組分檢測的酶聯(lián)免疫吸附法上．文獻(xiàn)［15］報道，Goryacheva等建立了一種串聯(lián)式酶聯(lián)免疫測定法同時檢測香辛料中的AFB1和 OTA，可同時對AFBl和 OTA定性分析;Ghali等對突尼斯人2004—2005年間消費的209份不同食物，用競爭性酶聯(lián)免疫方法分析AFT、OTA和ZEA的含量;Saha等用酶聯(lián)免疫法同時測定紅辣椒中的AFB1和OTA，滿足真菌毒素快速測定的需要;Saeger等建立了谷物中OTA和T-2同時檢測酶聯(lián)免疫吸附法，檢測結(jié)果分別用HPLC和GC-MS驗證，OTA假陽性和假陰性分別為2%和4%，T-2假陽性和假陰性分別為6%和3%．酶聯(lián)免疫吸附法用于真菌毒素檢測，由于存在交叉反應(yīng)而易造成假陽性，使復(fù)雜樣品受干擾，因此需要用其他方法來驗證．

3.2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法

色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測提高樣品通量，減少溶劑的損耗，是一種高效能、高選擇性、高靈敏度的分離分析方法，結(jié)合了色譜、質(zhì)譜兩者的優(yōu)點，使樣品的分離、定性及定量成為連續(xù)的過程，其在真菌毒素的分析檢測中應(yīng)用越來越廣泛．目前應(yīng)用廣泛的色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法主要有高效液相色譜一三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜一離子阱質(zhì)譜法、高效液相色譜一四級桿一飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法等．無論是哪種色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，前提是必須把樣品凈化干凈，有效地去除雜質(zhì)干擾，所以樣品的凈化處理至關(guān)重要［16］．

3.3 生物傳感器

生物傳感器(biosensors)是一種集現(xiàn)代生物技術(shù)與先進(jìn)的電子技術(shù)于一體的高科技產(chǎn)品，在食品檢測中已經(jīng)得到重視，隨著表面等離子體共振技術(shù)被應(yīng)用于生物傳感器，不但降低了檢測成本，而且商品化的等離子體共振設(shè)備便于攜帶，可以在野外條件下工作．利用等離子體共振生物傳感器檢測生物樣品時，首先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，在反應(yīng)池中放入未知濃度的樣品和一定濃度的抗體．液相中的待檢物質(zhì)首先與抗體結(jié)合，阻滯了傳感器表面的物質(zhì)與抗體結(jié)合，導(dǎo)致金屬膜表面溶液的折射率發(fā)生變化，隨即被等離子體共振生物傳感器檢測出來，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線就能測出樣品中待檢物質(zhì)的含量．文獻(xiàn)［16］報道，利用該技術(shù)同時檢測了 AFBl、ZEN、OTA、FBl和 DON 5 種毒素，從樣品提取到檢測完成(包括膜的再生)總共只需25 min．

3.4 時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析是超微量檢測中一項新興的檢測技術(shù)，是利用免疫反應(yīng)的高度特異性和標(biāo)記示蹤物的高靈敏度相結(jié)合而建立的一種微量物質(zhì)檢測技術(shù)．時間分辨熒光免疫分析法的原理相似于常用的免疫分析技術(shù)，只是采用了一種特殊的標(biāo)記物，即三價稀土離子(Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+等)代替同位素、酶標(biāo)記蛋白或熒光物質(zhì)等．當(dāng)抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的．該技術(shù)由于采用了三價原子標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記位點增多，極大地提高了方法學(xué)的靈敏度，并且原子標(biāo)記對生物質(zhì)活性影響小，有利于提高方法的穩(wěn)定性．由于不同的稀土離子具有不同的發(fā)射光譜和熒光壽命，利用該特點可以用不同的稀土離子標(biāo)記不同的抗原或抗體，從而能夠在一次分析中得到多個數(shù)據(jù)，實現(xiàn)多組分的同時檢測［16］．

3.5 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片(protein chips)是一種將數(shù)種甚至成百上千種已知蛋白質(zhì)分子固定在芯片基質(zhì)上的檢測方法，從混合樣品中捕捉目標(biāo)分子，再用能與已知蛋白分子特異性結(jié)合的蛋白分子對目標(biāo)分子進(jìn)行檢測，進(jìn)而分析得知哪些被測樣品中含有與已知蛋白分子結(jié)合的目標(biāo)分子．蛋白質(zhì)芯片的突出特點是可以對樣本進(jìn)行高通量、平行分析，信息量大，目前關(guān)于蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用已有大量報道．目前，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已逐步推廣使用到食品安全領(lǐng)域中，常用于食品中病原微生物的檢測、真菌毒素的檢測、農(nóng)獸藥殘留的檢測等，該方法的最大特點是簡便、快速、成本低［16］．

4 結(jié)束語

隨著人們對真菌毒素問題的日益關(guān)注和檢測技術(shù)研究的不斷深入，快速、高效、低成本、多通量的環(huán)境友好型檢測技術(shù)和手段是今后真菌毒素檢測的發(fā)展方向．在未來的真菌毒素檢測研究中，通過研究人員的不懈努力，相信可以發(fā)掘更多的新方法來提高快速檢測和同時檢測的效率，開辟真菌毒素聯(lián)合檢測的新領(lǐng)域．

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(責(zé)任編輯:王 寬)

Research Progress of Mycotoxin Detection Technologies

SHANG Yan-e
(National Center for Supervision and Inspection of Grain and Oil，Beijing 100162，China)

Some classic mycotoxin detection techniques were reviewed in this paper．The latest development in detection technologies was briefly introduced．And the development trend of mycotoxins detection technology，was summerized．

mycotoxins;rapid detection;multi-component detection

TS207．5

A

1671-1513(2012)04-0015-04

2012-06-26

尚艷娥，女，高級工程師，國家糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心總工程師，主要從事糧油安全檢測方面的研究．