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    犬細菌性腹瀉的細菌分離培養(yǎng)與鑒定

    2012-08-15 11:44:50云南省彌勒縣畜牧獸醫(yī)局652300
    山東畜牧獸醫(yī) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:麥康凱瓊脂細菌性

    張 麗 (云南省彌勒縣畜牧獸醫(yī)局 652300)

    肖 嘯* (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明)

    沈?qū)W文 (云南省紅河州動物疫病預(yù)防控制中心 蒙自)

    犬的腸道內(nèi)有大量潛在的致病菌,但不是每種細菌都與臨床疾病有明確的聯(lián)系。引起豬細菌性腹瀉的原因很多,特別是大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要原因,其發(fā)病率高,死亡率不高[1]。大腸稈菌、痢疾稈菌、沙門氏稈菌、魏氏棱菌、螺旋體感染等,都可引起羊只的腹瀉,并有可能發(fā)生較高的死亡率。其中以大腸桿菌引起的疾病最為嚴重,死亡率也最高。大腸桿菌也是引起牛細菌性腹瀉重要原因[2]。犬的致病菌包括:腸致病型大腸埃希氏菌、無致病性大腸桿菌、沙門氏菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、彎曲菌屬、毛狀芽孢桿菌、梭菌屬、葡萄球菌和志賀菌屬。其中以由大腸桿菌引起的最為常見,各年齡段的犬都易感致病性大腸桿菌,但多見于1~4月齡的仔犬,臨床上以敗血癥、發(fā)熱和腹瀉為特征,一年四季均可發(fā)生。但是由于春季氣溫多變,犬的抵抗力較弱,所以在春季本病表現(xiàn)的尤為突出。致病性大腸桿菌為革蘭氏陰性菌、無芽孢、有鞭毛的短小桿菌。致病性大腸桿菌的血清型非常多,其中可能引起犬細菌性腹瀉的血清型為O10、O85、O119、O18、O20、O70、O209、O339等。犬細菌性腹瀉的癥狀一般為精神沉郁,被毛粗亂、脫水、消瘦、腹部鼓脹,拉稀或者便血,體溫升高至40~41℃,有的犬伴有嘔吐的癥狀。嚴重的發(fā)生水瀉、肝門失禁呈里急后重,引起直腸脫出或伴發(fā)腸套疊的直腸脫出。發(fā)病動物采食量減少,極度消瘦、弓腰、眼窩下陷、乏力,臨死前體溫下降[3]。細菌性腹瀉往往會帶來動物死亡,生產(chǎn)性能降低等危害。那么引起犬細菌性腹瀉的病菌及其血清型值得探討。本試驗通過對細菌性腹瀉的犬糞便進行采樣,通過麥康凱鑒別培養(yǎng)基[4]進行細菌的分離培養(yǎng)、生化試驗與正常犬大腸菌群對比進行了細菌鑒定,再通過藥敏試驗找出細菌敏感的抗生素,這樣便可以在實際的治療中起到良好的指導(dǎo)作用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗藥物 慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、頭孢氨芐、菌必治等。

    1.1.2 試驗器材 生物顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、電爐、載玻片、蓋玻片、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、立式圓形壓力蒸汽滅菌器、冰箱、接種環(huán)、酒精燈等。

    1.1.3 試劑 乳糖、磷酸氫二鉀、氯化鈉、瓊脂、膽鹽、超純水、中性紅、結(jié)晶紫、95%乙醇、硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、拘櫞酸鹽、尿素、半固體瓊脂、葡萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖等。

    1.1.4 試驗動物 試驗犬均來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)院(西站)及康大媽流浪動物收容所。首先進行犬健康狀況狀況調(diào)查,調(diào)查內(nèi)容包括品種、年齡、性別、體重、臨床癥狀,引起犬腹瀉的原因。根據(jù)犬的臨床癥狀:出現(xiàn)嘔吐,慢性腸卡他,厭食,稀便,血便,漸進性消瘦,營養(yǎng)不良,精神不振,體溫升高,脫水等有典型腹瀉癥狀,經(jīng)診斷后排除病毒性腹瀉及寄生蟲腹瀉可能的犬。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 糞樣的采集 在動物醫(yī)院里,由于不可能隨時都能采到新鮮糞便樣品,所以采用棉棒采集每只試驗犬直腸深部少量糞便直接涂片觀察,并編號記錄被檢犬的年齡、營養(yǎng)狀況、品種、性別等,并保存待檢。本次試驗糞樣采集時間為0d:2010年4月20日,采到3個樣品分別編號1、2、3。1d:2010年4月21日采到4個樣品分別編號4、5、6、7。2d:2010年4月22日采到3個樣品,分別編號8、9、10。本次采樣的犬品種不一,有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年齡從1月齡至8歲之間。各個體的糞樣分別取2份。

    1.2.2 培養(yǎng)基制備 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基制備,麥康凱培養(yǎng)基用于腸道致病菌的選擇性分離培養(yǎng)。配方如下蛋白胨20.0g,乳糖10.0g,膽鹽5.0g,氯化鈉5.0g,中性紅0.03g,瓊脂14.0g,pH值7.1±0.2,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min備用。本次試驗使用的是由上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠生產(chǎn)的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,取樣品52g加入1000ml蒸餾水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解,115℃高壓滅菌15min備用。鑒定原理為蛋白胨提供碳氮源、維生素和生長因子;牛膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長;氯化鈉維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑;乳糖為可發(fā)酵的糖類;中性紅是pH指示劑,細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。

    1.2.3 糞樣檢測 每一個樣品分別取少量的糞樣經(jīng)無菌純水稀釋后涂于載玻片上等干后用革蘭氏染色法[5]染色之后進行鏡檢。

    1.2.4 接種培養(yǎng) 將樣品在超凈工作臺上分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,并且標明接種的編號。接種時用采樣的棉簽輕輕涂抹于培養(yǎng)基的一頭,之后用接種環(huán)以“之”字型畫開,每涂過培養(yǎng)皿的一半時旋轉(zhuǎn)90°,接種環(huán)燒白滅菌后繼續(xù)沿“之”字畫開。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

    1.2.5 生化鑒定 使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水楊素、甘露醇、蔗糖、七葉苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懶氨酸、麥芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、衛(wèi)矛醇、甲基紅實驗、V-P試驗、吲哚等分別配制生化鑒定管[5]。將培養(yǎng)皿中的典型菌種在超凈工作臺上接種至鑒定管中,24h后觀察結(jié)果。

    1.2.6 藥敏試驗 使用藥敏紙片呋喃妥因、鏈霉素、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、菌必治做兩組藥敏實驗。以上藥敏紙片均產(chǎn)自杭州天和生物試劑有限公司,執(zhí)行標準:WS/T125-1999。

    1.2.7 注意事項 在操作中嚴格按照無菌操作,使用明火、電時注意自身安全。實時記錄試驗數(shù)據(jù)。嚴格按照操作規(guī)程操作,注意保護設(shè)備安全完整。

    2 試驗結(jié)果

    2.1 糞樣檢測結(jié)果

    在每一個便樣的鏡檢中視野內(nèi)大量存在革蘭氏陰性、中等大小、兩端鈍圓的短桿菌,呈單個或多個散在排列。從形態(tài)和革蘭氏特性上判斷在視野中的細菌為大腸桿菌[6](圖1) 。

    2.2 接種培養(yǎng)結(jié)果

    所有麥康凱培養(yǎng)基中均有均勻紅色,邊緣整齊,中心突起,中等大小,表面光滑濕潤的散在菌落長出。其中1號培養(yǎng)皿有菌落200個,2號有菌落185個,3號有菌落50個,4號有菌落130個,5號又菌落70個,6號有菌落150個,7號有菌落134個,8號有菌落124個,9號有菌落125個,10號有菌落113個(圖2)。

    圖1 大腸桿菌革蘭氏染色1600倍鏡

    圖2 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況

    2.3 生化實驗結(jié)果

    見表1。

    表1 生化試驗結(jié)果

    2.4 藥敏試驗結(jié)果

    見表2。

    表2 藥敏實驗結(jié)果 (mm)

    3 討論

    3.1 生化分析

    生化試驗結(jié)果與動物傳染病書上大腸桿菌基本特性相符[8],而且與王云峰等[9]、孫善發(fā)等[10]的試驗結(jié)果相一致。該菌能夠分解麥芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸,產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不能產(chǎn)生硫化氫。因此從生化結(jié)果來看此菌種為大腸桿菌。

    3.2 藥敏分析

    從藥敏試驗的結(jié)果來看,該菌對頭孢類,和喹諾酮類[12]抗生素高度敏感,但是林可霉素、四環(huán)素、慶大霉素的治療效果不佳。這與有關(guān)的報道相符[11]。藥敏試驗說明該菌種已經(jīng)對常用的藥物產(chǎn)生耐藥性。當前在犬細菌性腹瀉的治療中常常出現(xiàn)亂用抗生素,或者使用了合適的抗生素卻達不到良好治療效果的現(xiàn)象。

    3.3 犬病治療中的誤區(qū)

    誤區(qū)一:一瀉就用止瀉藥。過早的服用止瀉藥,或者是止瀉藥服用不當,反而會延誤病情,甚至可以導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥。誤區(qū)二:先鎮(zhèn)痛緩解腹瀉,感染性腹瀉時可能會出現(xiàn)腹痛的現(xiàn)象,一些犬主則習(xí)慣給犬服用654-2、顛茄片等止痛劑,而且不按犬的的月齡,隨意使用。這種做法非常不安全,因為止痛后,不讓腸蠕動,會導(dǎo)致腸道蠕動功能癱瘓,腸音消失或減弱,容易引起腸黏膜脫落 ,便血。誤區(qū)三:一瀉就吃消炎藥,許多人一看到犬腹瀉,就使用復(fù)方新諾明或諾氟沙星等抗生素。其實這種做法是不合適的。因腹瀉有感染性和非感染性兩類,非感染性腹瀉可由飲食不當、食物過敏、生活地域的改變、氣候突變等原因引起,此類腹瀉使用抗生素治療是無效的,而應(yīng)當服用一些助消化藥或采用飲食療法等。即便是感染性腹瀉,在選用抗生素時,最好先做大便細菌培養(yǎng),明確致病菌種類,再選用對細菌最敏感的抗生素進行治療。切不可濫用抗生素。 誤區(qū)四:瀉止就停藥,有的人腹瀉常依癥狀服藥,即腹瀉重時多服藥,腹瀉輕時少服藥,稍有好轉(zhuǎn)就停藥。這樣做很容易造成治療不徹底而使腹瀉復(fù)發(fā),或轉(zhuǎn)為慢性腹瀉,給治療帶來很多困難[7]。正確的使用抗生素后,就不能隨便停用,否則就容易使細菌產(chǎn)生耐藥性。

    3.4 試驗犬與健康犬腸道菌比較

    通過對引起犬細菌性腹瀉的細菌進行分離鑒定得出的結(jié)果與健康犬的常規(guī)腸道菌進行對比發(fā)現(xiàn)。在正常的犬腸道內(nèi)存在著許多種類的細菌其中包括需氧、兼性厭氧、厭氧細菌、真菌在內(nèi)的45個菌屬的約164種菌。涉及菌種包括鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、埃希菌、雙歧桿菌、擬桿菌、乳桿菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌與鏈格孢霉等[13],通過對正常犬只的大便進行培養(yǎng)也證明了這點。而引起這次細菌性腹瀉的細菌培養(yǎng)后主要得到的是大腸桿菌,說明了這些犬的細菌性腹瀉主要是由致病性大腸桿菌引起的。

    4 結(jié)論

    通過試驗得到了兩個結(jié)論,首先春季在昆明地區(qū)犬細菌性腹瀉的原因主要是由大腸桿菌引起的。造成這種現(xiàn)象的原因可能是應(yīng)為在春季食物容易變質(zhì),而畜主不注意犬的衛(wèi)生,使犬食用了不潔的食物或水造成的。第二可能是因為經(jīng)常使用抗生素的原因,這類大腸桿菌已經(jīng)對一些常用的抗生素產(chǎn)生了耐藥性,因此在平時的診治過程中,建議使用頭孢類或喹諾酮類的抗生素進行治療。平時應(yīng)該注意不要亂用抗生素,使用后不要隨意停用,應(yīng)該按療程使用,不可長時間使用一種抗生素以免細菌產(chǎn)生耐藥性。

    [1] 談永進, 趙啟立, 陳曉生. 豬病原菌性腹瀉及其防治[J]. 畜禽業(yè).2009(3). 70-71.

    [2] 趙輝玲. 羊的常見細菌性傳染病(上)[M]. 合肥: 安徽科技出版社.2007.

    [3] 馬衛(wèi)明, 王建坤, 王春璈等. 簡明寵物疾病診斷與防治[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2009.

    [4] 陳天壽主編. 微生物培養(yǎng)基的制備與應(yīng)用[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995.

    [5] 姚火春主編. 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

    [6] 陸承平主編. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

    [7] 王春璈主編. 簡明寵物疾病診斷與防治[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009.

    [8] 陳溥言主編. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

    [9] 王云峰, 王翠蘭, 崔尚金. 兔致病性大腸桿菌生物學(xué)的研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 1999, 21(5): 334-335.

    [10] 孫善發(fā), 林鳳仙, 蔡文林. 兔致病性大腸埃希氏菌分離與血清型鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 1998, 24(4): 20-21.

    [11] 苗宏光, 靳兆江. 兔大腸桿菌病的診治[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 2000,21(4): 39-40.

    [12] 閻繼業(yè)主編. 畜禽藥物手冊[M]. 北京:金盾出版社, 2007.

    [13] 林德貴. 犬腸道抗菌藥物相關(guān)性菌群失調(diào)的微生物學(xué)與組織病理學(xué)研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科學(xué), 2008.

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