犬細菌性腹瀉的細菌分離培養(yǎng)與鑒定

張 麗 （云南省彌勒縣畜牧獸醫(yī)局 652300）

肖 嘯* （云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明）

沈?qū)W文 （云南省紅河州動物疫病預(yù)防控制中心 蒙自）

犬的腸道內(nèi)有大量潛在的致病菌，但不是每種細菌都與臨床疾病有明確的聯(lián)系。引起豬細菌性腹瀉的原因很多，特別是大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要原因，其發(fā)病率高，死亡率不高[1]。大腸稈菌、痢疾稈菌、沙門氏稈菌、魏氏棱菌、螺旋體感染等，都可引起羊只的腹瀉，并有可能發(fā)生較高的死亡率。其中以大腸桿菌引起的疾病最為嚴重，死亡率也最高。大腸桿菌也是引起牛細菌性腹瀉重要原因[2]。犬的致病菌包括：腸致病型大腸埃希氏菌、無致病性大腸桿菌、沙門氏菌屬、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、彎曲菌屬、毛狀芽孢桿菌、梭菌屬、葡萄球菌和志賀菌屬。其中以由大腸桿菌引起的最為常見，各年齡段的犬都易感致病性大腸桿菌，但多見于1～4月齡的仔犬，臨床上以敗血癥、發(fā)熱和腹瀉為特征，一年四季均可發(fā)生。但是由于春季氣溫多變，犬的抵抗力較弱，所以在春季本病表現(xiàn)的尤為突出。致病性大腸桿菌為革蘭氏陰性菌、無芽孢、有鞭毛的短小桿菌。致病性大腸桿菌的血清型非常多，其中可能引起犬細菌性腹瀉的血清型為O10、O85、O119、O18、O20、O70、O209、O339等。犬細菌性腹瀉的癥狀一般為精神沉郁，被毛粗亂、脫水、消瘦、腹部鼓脹，拉稀或者便血，體溫升高至40～41℃，有的犬伴有嘔吐的癥狀。嚴重的發(fā)生水瀉、肝門失禁呈里急后重，引起直腸脫出或伴發(fā)腸套疊的直腸脫出。發(fā)病動物采食量減少，極度消瘦、弓腰、眼窩下陷、乏力，臨死前體溫下降[3]。細菌性腹瀉往往會帶來動物死亡，生產(chǎn)性能降低等危害。那么引起犬細菌性腹瀉的病菌及其血清型值得探討。本試驗通過對細菌性腹瀉的犬糞便進行采樣，通過麥康凱鑒別培養(yǎng)基[4]進行細菌的分離培養(yǎng)、生化試驗與正常犬大腸菌群對比進行了細菌鑒定，再通過藥敏試驗找出細菌敏感的抗生素，這樣便可以在實際的治療中起到良好的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物 慶大霉素、鏈霉素、林可霉素、頭孢氨芐、菌必治等。

1.1.2 試驗器材 生物顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、電爐、載玻片、蓋玻片、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、立式圓形壓力蒸汽滅菌器、冰箱、接種環(huán)、酒精燈等。

1.1.3 試劑 乳糖、磷酸氫二鉀、氯化鈉、瓊脂、膽鹽、超純水、中性紅、結(jié)晶紫、95%乙醇、硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、拘櫞酸鹽、尿素、半固體瓊脂、葡萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖等。

1.1.4 試驗動物 試驗犬均來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)院(西站)及康大媽流浪動物收容所。首先進行犬健康狀況狀況調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括品種、年齡、性別、體重、臨床癥狀，引起犬腹瀉的原因。根據(jù)犬的臨床癥狀：出現(xiàn)嘔吐，慢性腸卡他，厭食，稀便，血便，漸進性消瘦，營養(yǎng)不良，精神不振，體溫升高，脫水等有典型腹瀉癥狀，經(jīng)診斷后排除病毒性腹瀉及寄生蟲腹瀉可能的犬。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞樣的采集 在動物醫(yī)院里，由于不可能隨時都能采到新鮮糞便樣品，所以采用棉棒采集每只試驗犬直腸深部少量糞便直接涂片觀察，并編號記錄被檢犬的年齡、營養(yǎng)狀況、品種、性別等，并保存待檢。本次試驗糞樣采集時間為0d：2010年4月20日，采到3個樣品分別編號1、2、3。1d：2010年4月21日采到4個樣品分別編號4、5、6、7。2d：2010年4月22日采到3個樣品，分別編號8、9、10。本次采樣的犬品種不一，有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年齡從1月齡至8歲之間。各個體的糞樣分別取2份。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基制備，麥康凱培養(yǎng)基用于腸道致病菌的選擇性分離培養(yǎng)。配方如下蛋白胨20.0g，乳糖10.0g，膽鹽5.0g，氯化鈉5.0g，中性紅0.03g，瓊脂14.0g，pH值7.1±0.2，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min備用。本次試驗使用的是由上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠生產(chǎn)的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，取樣品52g加入1000ml蒸餾水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解，115℃高壓滅菌15min備用。鑒定原理為蛋白胨提供碳氮源、維生素和生長因子；牛膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；乳糖為可發(fā)酵的糖類；中性紅是pH指示劑，細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。

1.2.3 糞樣檢測 每一個樣品分別取少量的糞樣經(jīng)無菌純水稀釋后涂于載玻片上等干后用革蘭氏染色法[5]染色之后進行鏡檢。

1.2.4 接種培養(yǎng) 將樣品在超凈工作臺上分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，并且標明接種的編號。接種時用采樣的棉簽輕輕涂抹于培養(yǎng)基的一頭，之后用接種環(huán)以“之”字型畫開，每涂過培養(yǎng)皿的一半時旋轉(zhuǎn)90°，接種環(huán)燒白滅菌后繼續(xù)沿“之”字畫開。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

1.2.5 生化鑒定 使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水楊素、甘露醇、蔗糖、七葉苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懶氨酸、麥芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、衛(wèi)矛醇、甲基紅實驗、V-P試驗、吲哚等分別配制生化鑒定管[5]。將培養(yǎng)皿中的典型菌種在超凈工作臺上接種至鑒定管中，24h后觀察結(jié)果。

1.2.6 藥敏試驗 使用藥敏紙片呋喃妥因、鏈霉素、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、菌必治做兩組藥敏實驗。以上藥敏紙片均產(chǎn)自杭州天和生物試劑有限公司，執(zhí)行標準：WS/T125-1999。

1.2.7 注意事項 在操作中嚴格按照無菌操作，使用明火、電時注意自身安全。實時記錄試驗數(shù)據(jù)。嚴格按照操作規(guī)程操作，注意保護設(shè)備安全完整。

2 試驗結(jié)果

2.1 糞樣檢測結(jié)果

在每一個便樣的鏡檢中視野內(nèi)大量存在革蘭氏陰性、中等大小、兩端鈍圓的短桿菌，呈單個或多個散在排列。從形態(tài)和革蘭氏特性上判斷在視野中的細菌為大腸桿菌[6](圖1) 。

2.2 接種培養(yǎng)結(jié)果

所有麥康凱培養(yǎng)基中均有均勻紅色，邊緣整齊，中心突起，中等大小，表面光滑濕潤的散在菌落長出。其中1號培養(yǎng)皿有菌落200個，2號有菌落185個，3號有菌落50個，4號有菌落130個，5號又菌落70個，6號有菌落150個，7號有菌落134個，8號有菌落124個，9號有菌落125個，10號有菌落113個(圖2)。

圖1 大腸桿菌革蘭氏染色1600倍鏡

圖2 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況

2.3 生化實驗結(jié)果

見表1。

表1 生化試驗結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

見表2。

表2 藥敏實驗結(jié)果 (mm)

3 討論

3.1 生化分析

生化試驗結(jié)果與動物傳染病書上大腸桿菌基本特性相符[8]，而且與王云峰等[9]、孫善發(fā)等[10]的試驗結(jié)果相一致。該菌能夠分解麥芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能產(chǎn)生硫化氫。因此從生化結(jié)果來看此菌種為大腸桿菌。

3.2 藥敏分析

從藥敏試驗的結(jié)果來看，該菌對頭孢類，和喹諾酮類[12]抗生素高度敏感，但是林可霉素、四環(huán)素、慶大霉素的治療效果不佳。這與有關(guān)的報道相符[11]。藥敏試驗說明該菌種已經(jīng)對常用的藥物產(chǎn)生耐藥性。當前在犬細菌性腹瀉的治療中常常出現(xiàn)亂用抗生素，或者使用了合適的抗生素卻達不到良好治療效果的現(xiàn)象。

3.3 犬病治療中的誤區(qū)

誤區(qū)一：一瀉就用止瀉藥。過早的服用止瀉藥，或者是止瀉藥服用不當，反而會延誤病情，甚至可以導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥。誤區(qū)二：先鎮(zhèn)痛緩解腹瀉，感染性腹瀉時可能會出現(xiàn)腹痛的現(xiàn)象，一些犬主則習(xí)慣給犬服用654-2、顛茄片等止痛劑，而且不按犬的的月齡，隨意使用。這種做法非常不安全，因為止痛后，不讓腸蠕動，會導(dǎo)致腸道蠕動功能癱瘓，腸音消失或減弱，容易引起腸黏膜脫落 ，便血。誤區(qū)三：一瀉就吃消炎藥，許多人一看到犬腹瀉，就使用復(fù)方新諾明或諾氟沙星等抗生素。其實這種做法是不合適的。因腹瀉有感染性和非感染性兩類，非感染性腹瀉可由飲食不當、食物過敏、生活地域的改變、氣候突變等原因引起，此類腹瀉使用抗生素治療是無效的，而應(yīng)當服用一些助消化藥或采用飲食療法等。即便是感染性腹瀉，在選用抗生素時，最好先做大便細菌培養(yǎng)，明確致病菌種類，再選用對細菌最敏感的抗生素進行治療。切不可濫用抗生素。 誤區(qū)四：瀉止就停藥，有的人腹瀉常依癥狀服藥，即腹瀉重時多服藥，腹瀉輕時少服藥，稍有好轉(zhuǎn)就停藥。這樣做很容易造成治療不徹底而使腹瀉復(fù)發(fā)，或轉(zhuǎn)為慢性腹瀉，給治療帶來很多困難[7]。正確的使用抗生素后，就不能隨便停用，否則就容易使細菌產(chǎn)生耐藥性。

3.4 試驗犬與健康犬腸道菌比較

通過對引起犬細菌性腹瀉的細菌進行分離鑒定得出的結(jié)果與健康犬的常規(guī)腸道菌進行對比發(fā)現(xiàn)。在正常的犬腸道內(nèi)存在著許多種類的細菌其中包括需氧、兼性厭氧、厭氧細菌、真菌在內(nèi)的45個菌屬的約164種菌。涉及菌種包括鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、埃希菌、雙歧桿菌、擬桿菌、乳桿菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌與鏈格孢霉等[13]，通過對正常犬只的大便進行培養(yǎng)也證明了這點。而引起這次細菌性腹瀉的細菌培養(yǎng)后主要得到的是大腸桿菌，說明了這些犬的細菌性腹瀉主要是由致病性大腸桿菌引起的。

4 結(jié)論

通過試驗得到了兩個結(jié)論，首先春季在昆明地區(qū)犬細菌性腹瀉的原因主要是由大腸桿菌引起的。造成這種現(xiàn)象的原因可能是應(yīng)為在春季食物容易變質(zhì)，而畜主不注意犬的衛(wèi)生，使犬食用了不潔的食物或水造成的。第二可能是因為經(jīng)常使用抗生素的原因，這類大腸桿菌已經(jīng)對一些常用的抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此在平時的診治過程中，建議使用頭孢類或喹諾酮類的抗生素進行治療。平時應(yīng)該注意不要亂用抗生素，使用后不要隨意停用，應(yīng)該按療程使用，不可長時間使用一種抗生素以免細菌產(chǎn)生耐藥性。

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[5] 姚火春主編. 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[6] 陸承平主編. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

[7] 王春璈主編. 簡明寵物疾病診斷與防治[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009.

[8] 陳溥言主編. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

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[13] 林德貴. 犬腸道抗菌藥物相關(guān)性菌群失調(diào)的微生物學(xué)與組織病理學(xué)研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科學(xué), 2008.