人副流感病毒入侵宿主細胞的分子機制

賀 英，薛 倩，安艷娟，胡陳瑩，李姝槿，郝云霞，魏博欣

(河北科技師范學院動物科技學院，河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北秦皇島，066600)

人副流感病毒(human parainfluenza virus，HPIV)發(fā)現(xiàn)于20世紀50年代末，原名仙臺病毒，最初從日本仙臺市一例死于肺炎的患兒肺液中分離獲得。據(jù)統(tǒng)計，大約30% ～40%的嬰幼兒急性呼吸道感染都是由HPIV引起的。HPIV1型、2型和3型是引起世界各地多數(shù)兒童義膜性喉頭炎、細支氣管炎和肺炎的主要原因［1］。HPIV3引起的病例占美國小兒科呼吸住院治療病例的11%，是引起嬰兒義膜性喉頭炎的主要原因;而HPIV1和HPIV2傾向于感染年齡較大的兒童和青少年。其他兒童呼吸系統(tǒng)疾病如流行性感冒和麻疹已經(jīng)通過免疫接種計劃和抗病毒治療得到某種程度的控制，也開發(fā)了一些有效的預防策略。但是對于副流感病毒，并沒有有效的治療手段，所以在預防和治療副流感病毒方面遠遠落后于對其他疾病的預防和治療。

副流感病毒的抗病毒治療方法目前尚沒有深入的研究報道，探明該病毒生命周期的特征可以發(fā)現(xiàn)病毒的弱點來加以攻擊。HPIV通過結合受體分子來進入靶細胞，然后融合病毒包膜和宿主細胞膜進入細胞質。受體結合、細胞膜融合和進入是病毒入侵的關鍵步驟，所以干擾病毒生命周期從而預防疾病是目前控制病毒的主要研究策略。了解病毒入侵的分子作用機制是理解呼吸疾病的發(fā)病原理和預防治療的基礎。

1 副流感病毒及其生命周期

1．1 病毒的結構

人副流感病毒是副粘病毒科內(nèi)的呼吸道病毒和腮腺炎病毒的成員。病毒為粗糙的球形，直徑大約150～400 nm，有包膜。包膜在病毒出芽時由宿主細胞膜形成，由宿主細胞脂類和糖蛋白組成。包膜表面突出2種糖蛋白:一種為血球凝集素-神經(jīng)氨酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase，HN)，具有紅細胞凝集活性和神經(jīng)氨酸酶活性;另一種為融合蛋白(fusion protein，F(xiàn)蛋白)，有2種亞型F1和F2，具有促進細胞融合和溶血特性。包膜內(nèi)層由維持結構完整性的非糖基化蛋白組成，即基質蛋白(M蛋白)。HPIV基因組為單鏈負鏈RNA，在其翻譯成蛋白質之前必須先轉錄成正義鏈。HPIV像所有的負鏈RNA病毒一樣，在病毒粒子中編碼和包裝一個RNA依賴的RNA聚合酶復合體。包括緊密包繞RNA基因組的核衣殼蛋白(NP)，磷蛋白和大蛋白。RNA基因組大約15 500個核苷酸，并且被病毒核衣殼蛋白殼體化而形成螺線形RNA-衣殼蛋白復合體［2］。

1．2 病毒的生活周期

副流感病毒細胞感染的第一步是靶細胞的結合，即病毒受體結合的分子(血細胞凝集素神經(jīng)氨酸酶)與細胞表面的含唾液酸的受體分子的互作。然后，病毒包膜直接與細胞質膜融合，通過病毒融合蛋白質(F蛋白質)介導并釋放核衣殼進入到細胞質里［3，4］。融合后釋放到細胞質的核衣殼蛋白包含與病毒核衣殼蛋白緊緊結合的基因組RNA，這種蛋白質RNA復合物是病毒RNA基因組復制和轉錄的模板，而復制和轉錄的產(chǎn)物最終包裝成后代的病毒體。病毒基因組編碼2個病毒表面的糖蛋白HN蛋白和F蛋白，參與病毒組裝和出芽的基質蛋白，RNA聚合酶蛋白和RNA蛋白質殼體化的蛋白;而且通過改變RNA讀碼框或RNA編輯，在感染細胞中可以合成一個或多個非結構蛋白，這些蛋白可以幫助病毒逃避宿主的免疫應答。

病毒核衣殼蛋白依照一定的規(guī)則組裝，新組裝的核衣殼蛋白包括病毒的全長RNA基因組和聚合酶蛋白質，通過細胞膜出芽形成包括F和HN蛋白質以及基質蛋白的病毒粒子。在兩極分化的上皮細胞中，病毒從細胞頂端表面出芽?；|蛋白與核蛋白殼結合并且與HN和F蛋白質的細胞質尾巴結合，用這種方法間接的排列核衣殼蛋白以及細胞膜區(qū)域的病毒糖蛋白，以便病毒出芽［5］。HN分子的神經(jīng)氨酸苷酶和受體切割活性，酶切含有神經(jīng)氨酸的受體分子(該分子將病毒的HN蛋白黏附到細胞表面)，從而允許新發(fā)芽的病毒粒子從細胞表面釋放下來，開始進行病毒下一個周期的傳染［6，7］。

2 HN蛋白在受體結合、受體切割以及激活F蛋白質融合的作用

由于副流感病毒的HN蛋白兼具紅血球凝聚(唾液酸包含的受體結合)和神經(jīng)氨酸酶(唾液酸包含受體的切割)活性，人副流感病毒HN蛋白質是不同于其他副粘液病毒屬的受體結合糖蛋白。副流感HN蛋白質的氨基端延伸到細胞質而羧基端在細胞外，在細胞表面和病毒上由二硫鍵連接的二聚體組成四聚物［8］。HN分子包含胞質域、跨膜區(qū)、頸部區(qū)和球狀頭。新城疫病毒(NDV)的HN蛋白質和HPIV的HN蛋白的晶體結構研究表明，球狀頭部主要包含唾液酸結合位點和神經(jīng)氨酸酶激活位點［9～11］。

除了幫助病毒吸附到細胞表面和復制后從細胞釋放病毒粒子的功能外，HN蛋白與其受體的互作還是病毒感染過程中F蛋白介導的細胞膜融合所必需的［12，13］。研究發(fā)現(xiàn)，對大多數(shù)副黏病毒而言，HN蛋白是F蛋白介導的融合過程必需的。受體結合是這一過程的重要組成部分，F(xiàn)蛋白為了介導病毒和細胞膜融合需要同一種病毒的HN蛋白存在［14～16］。這可能是因為HN和F蛋白質之間的相互作用是特異的，兩個蛋白的結構和特殊互作關系是維持他們功能必需的［17，18］。副流感病毒HN蛋白結合到受體上，在激活或“激活”F蛋白呈現(xiàn)融合準備完畢的構象中扮演重要作用［19，20］。由于激活后F蛋白的融合肽區(qū)域插入到靶細胞膜里是膜融合的關鍵步驟，HN蛋白的F蛋白激活效率將影響F蛋白介導融合程度和病毒入侵。

3 有包膜病毒侵入期間激活了病毒包膜與宿主細胞膜融合

所有包膜病毒進入宿主細胞都需要病毒和宿主細胞膜融合。介導該融合過程的融合蛋白在不同包膜病毒不同，這些蛋白質根據(jù)機制劃為2類。I類蛋白的融合蛋白，有副粘液病毒流感血凝素蛋白，艾滋病病毒gp120融合蛋白，埃博拉病毒融合蛋白［21］。每個蛋白都是先合成形成三聚體的1個單一多肽鏈，然后由宿主蛋白酶切割成2個亞基，露出插入到靶細胞膜的融合肽［22～24］。這一過程激活了一系列的F蛋白構像改變，導致病毒包膜與宿主細胞膜的融合途徑不同，這種不同取決于病毒進入細胞的途徑以及融合是否需要在中性pH值條件下或內(nèi)體內(nèi)發(fā)生。流感血凝素蛋白已經(jīng)成為I類融合最廣泛的研究模式，內(nèi)體的酸性pH值引發(fā)構象變化，允許病毒和內(nèi)體膜融合［24，25］。Ⅱ類融合蛋白包括黃病毒屬登革病毒包膜蛋白［26］，蜱傳播的腦炎病毒包膜蛋白［27］，披膜病毒屬的Semliki森林病毒E1蛋白［28］。盡管I類和Ⅱ類融合蛋白的結構有明顯差異，他們通過相似的結構過渡到融合狀態(tài)足以說明共同的機制［29］。

副粘病毒的融合過程發(fā)生在中性pH值靶細胞的表面，當鄰近的HN蛋白結合到含有唾液酸的受體時，F(xiàn)蛋白質激活，允許發(fā)生融合。對于HPIV3，HN蛋白與其受體的結合激活F蛋白與靶細胞的細胞膜融合，HN蛋白改變可以改變其激活F蛋白的能力［19］。埋在F蛋白三聚體中的融合肽，為了嵌入到靶細胞膜內(nèi)必須暴露出來，輔助受體結合，無論是HN蛋白或F蛋白，兩者缺一不可。最新的副粘病毒F蛋白的結構和實驗數(shù)據(jù)得出了I類融合蛋白在融合過程中構像變遷的模型［20，21，30，31］。該F蛋白膜錨定亞基的膜外域包含2個疏水性結構域，即融合肽和跨膜結構域。每個結構域分別毗鄰HN蛋白的2個末端保守七肽重復序列(HR)區(qū)域:融合肽與N-末端HR(HR-N)相鄰，跨膜域與C-末端HR(HR-C)相鄰。這些HR域可以組成幾個α螺旋卷曲螺旋。一旦F蛋白被激活，融合肽進入靶細胞膜內(nèi)，首先產(chǎn)生一個短暫的“prehairpin”(前發(fā)卡)中間體，這個中間體被病毒和細胞膜固定。這種形式再折疊和組裝成一個基因型6-螺旋束的結構，HR-N和HR-C聯(lián)合進入一個攜帶N端和C端反平行排列對齊的密封復合體。由此產(chǎn)生的螺旋卷曲棒毗鄰于融合肽，形成一個高度穩(wěn)定的6-螺旋束。再折疊過程使融合肽和跨膜域的位置發(fā)生重排，從而錨定螺旋束的同一端，使病毒和細胞膜結合在一起。超螺旋結構的形成過程中，產(chǎn)生自由能使細胞膜與病毒包膜相互靠近，是膜融合的驅動力［20］。

通過合成對應F蛋白HR區(qū)域的多肽已經(jīng)研究了HN蛋白激活F蛋白的功能。衍生自許多副粘病毒HR區(qū)域的合成肽，能夠通過與F蛋白HR區(qū)域的互補結合，阻止HR-N和HR-C折疊成融合所需的穩(wěn)定的6-螺旋束結構，進而抑制病毒和宿主細胞膜的融合［21，30］。這些研究表明，血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白與含唾液酸的受體的結合引發(fā)了F蛋白構像改變［20］。有模型表明，受體結合后，經(jīng)歷了血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白本身的一個受體誘導的構象變化，從而激活了F蛋白的構象變化［3，13］。使用沒有HN蛋白的F蛋白融合實驗結果表明，HN蛋白的存在降低了F蛋白介導的融合所需要的活化能［32］。

4 HN蛋白激活F蛋白介導的膜融合過程

血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白有3個功能(受體結合、神經(jīng)氨酸酶和F-蛋白激活)，每一個都影響病毒的融合潛力。采用系列HN蛋白突變體以確定HN蛋白3個功能對應的特異性區(qū)域，是定量檢測F蛋白激活的策略［31］。HN突變體表現(xiàn)F蛋白激活缺陷，表明F蛋白激活是HN蛋白的一個獨立功能。體外試驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)蛋白嵌入到靶細胞膜或細胞間融合，是病毒進入靶細胞的第一步驟;雖然不同于自然狀態(tài)下人類的肺感染，HN受體結合、F蛋白質激活和F蛋白嵌入可以在上皮細胞培養(yǎng)或動物模型上進行機制研究。

HN蛋白突變后的病毒更具有誘導病毒與宿主細胞融合的潛力，這些改變的HN蛋白導致其增加了與受體的親和力或降低了神經(jīng)氨酸酶活性。這就說明，HN蛋白與其受體相互作用是F蛋白激活必需的。與野生型相比，增加受體親和力或降低酶活性(受體切割)使HN蛋白與其受體保持在結合后功能狀態(tài)的時間更長［18］。HN蛋白的細胞表面受體結合和神經(jīng)氨酸酶活性，都可通過影響HN-受體的結合持續(xù)時間，調節(jié)F蛋白激活和融合促進。降低神經(jīng)氨酸酶活性的變異病毒包含1個在HN分子莖部的突變(P111S)和1個在球狀頭部突變。該病毒確實是神經(jīng)氨酸酶缺陷，但該突變體病毒在促進融合細胞中也是有缺陷的［18］。這表明，HN蛋白特定的激活F蛋白的功能，且這一功能區(qū)定位于該蛋白的頸部區(qū)域。

使用含唾液酸受體類似物神經(jīng)氨酸酶抑制劑化合物，4-呱基-神經(jīng)鞘氨脂(4-GU-DANA;扎那米韋，樂瑞薩)，研究HN蛋白的F蛋白激活功能。結果發(fā)現(xiàn)，4-GU-DANA可抑制HPIV唾液酸苷酶活性，但不能阻止病毒從被感染的細胞表面釋放;該藥物阻斷了副流感病毒HN蛋白和受體間相互作用，有助于從被感染的細胞中釋放新組裝的病毒［33，34］。但是，通過干擾HN-受體相互作用，4-GU-DANA阻礙受體結合，從而阻止融合和病毒入侵［7，34，35］。這些有趣的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)刺激了科學家們設計病毒結合/進入抑制因子，治療副粘病毒感染的興趣。

比較野生型和突變型HN蛋白激活野生型F蛋白的能力，結果發(fā)現(xiàn)，來源于唾液酸苷酶缺陷/融合缺陷的病毒突變體產(chǎn)生的HN蛋白有2個氨基酸改變(D216N在球狀頭，P111S在莖上)，無論與野生的HN蛋白相比或者是僅一個突變D216N的HN蛋白相比，F(xiàn)-蛋白激活都比較慢。與單一突變P111S HN蛋白比較顯示，這種激活延遲完全歸因于P111S突變［19］。在HN莖部區(qū)域上的改變雖然沒有降低受體結合活性，卻大大減少了F蛋白激活。溫度和pH值不允許神經(jīng)氨酸酶活性的條件消除了HN蛋白神經(jīng)氨酸酶活性的影響。由于F蛋白激活減少，細胞融合也明顯減少［19］。含有雙突變D216N/P111S HN蛋白的病毒是唯一發(fā)現(xiàn)的副粘病毒變種，該病毒HN蛋白的F蛋白激活功能缺陷和融合促進作用缺陷，第一次將融合缺陷明確歸因于HN蛋白的激活功能缺陷，而不依賴于HN蛋白的其他功能。

5 HN蛋白調節(jié)其激活F蛋白能力的特性

在3個HN蛋白功能均可評估的條件下研究HN蛋白突變體的功能時，這些限定病毒入侵的特性之間的平衡就會變得明顯［18］。在pH值接近最佳的神經(jīng)氨酸酶活性(pH 5．7)時，由野生型HN蛋白引起的F蛋白激活大大減少，神經(jīng)氨酸酶使靶細胞受體從HN蛋白上釋放下來，激活融合發(fā)生很少。沒有神經(jīng)氨酸酶活性的HN蛋白(D216N/P111S的HN)，F(xiàn)蛋白激活的比例和程度在pH 5．7和pH 8．0(神經(jīng)氨酸酶沒有活性的pH值)下是相同的。這說明，對野生型 HN蛋白而言，低pH值降低了F蛋白激活，增強了神經(jīng)氨酸酶的活性。雙突變HN蛋白與P111S突變的HN比較揭示了HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性對其其他功能的影響:P111S突變HN(有殘余神經(jīng)氨酸苷酶活性)釋放可逆結合的HN蛋白受體，不像D216N/P111S雙突變的HN，通過維持長時間與受體的接觸延遲啟動融合［19］。在有助于增加神經(jīng)氨酸酶活性的pH值(pH 5．7)下，完全喪失了由P111S HN引起的融合啟動。通過比較不同神經(jīng)氨酸酶活性的HN蛋白，說明了這種酶在調節(jié)F蛋白激活中起著關鍵性的作用:神經(jīng)氨酸酶減少了HN蛋白繼續(xù)與靶細胞受體接觸的幾率，從而避免HN蛋白受體結合啟動的F蛋白激活。

為了評估受體親和力對F蛋白激活的影響，構建了具有比野生型HN蛋白高的受體親和力并擁有野生型神經(jīng)氨酸酶活性的HN突變體(T193A)。結果發(fā)現(xiàn)，該突變體的F蛋白激活效率在pH 5．7和pH 8．0保持一樣高，靶細胞受體釋放在pH 5．7和pH 8．0一樣低。這表明，較高的受體親和力抵消了增加神經(jīng)氨酸酶活性的影響。神經(jīng)氨酸酶活性和受體結合親和力都影響受體的可用性，從而影響了F蛋白激活的效率。因此，雖然HN蛋白莖部區(qū)的突變(如P111S)影響HN蛋白激活F蛋白的潛力，這種潛力也受影響HN-受體相互作用的球形頭部的變化而調整。激活F蛋白完全取決于HN-受體相互作用，而且HN蛋白的每一個功能各自獨立的影響HN蛋白的能力，以配合調節(jié)融合的F蛋白［18，19］。

6 HN蛋白-受體相互作用對體內(nèi)發(fā)病機制的貢獻

對于HPIVS，病毒感染引發(fā)的病理學反應、免疫保護反應和疾病增強的炎癥反之間的相互作用并不是很清楚。在許多情況下，疾病嚴重程度增加，疾病的臨床病理現(xiàn)象實際由于炎癥反應而不是病毒的細胞毒效應。隨著疾病癥狀出現(xiàn)的時間推移，病毒感染的宿主細胞的病毒滴度逐漸減少，而且病毒滴度和下呼吸道疾病的嚴重性沒有相關性。采用棉鼠疾病模型分析了HPIV3體內(nèi)發(fā)病機制的影響因素。模擬人類疾病，實驗感染HPIV的棉鼠導致支氣管上皮細胞感染和細支氣管炎［36］。在研究中用野生型(WT)HPIV3和3個HN突變體感染棉鼠，3個突變型分別為:HN的T193A(高親和力受體，球狀頭部突變)，HN的H552Q(高受體活性，二聚體界面突變)和HN的D216N(神經(jīng)氨酸酶的活性低，球形頭突變);與野生病毒相比，在感染鼠體內(nèi)的變異病毒保留了變異病毒的嗜斑形態(tài)，且在感染的動物中沒有發(fā)生回復為野生型的突變。出乎意料的是每個HN蛋白變化導致HPIV3引起疾病的極大不同，并且這種作用與病毒復制的影響沒有關系。這些變種引起肺泡炎和間質性浸潤，然而野生型病毒只引起細支氣管周炎，疾病加重歸因于HN的變異，HN的變異大大地增加了炎性細胞在肺泡和肺泡間質中浸潤，顯著的特點是肺泡壁增厚，氣管內(nèi)炎性細胞明顯增加。這些結果表明，這些差異是由于不同HN蛋白對炎癥反應的調整，而且與病毒的復制或傳染性沒關系［37］。

可以推測，無論是改變HN蛋白對受體的親和力還是改變其受體切割活性都可能改變宿主的炎癥反應性質。使用HN突變體詳細研究增強疾病的病因，有可能明確有哪些免疫系統(tǒng)響應的組成部分與HPIV3引發(fā)疾病有關。事實上，初步試驗表明，棉鼠感染后觀察到的增強病理現(xiàn)象，對于每一種HN蛋白變異HPIV來說，相應的趨化因子特異性變化有特別明顯的不同。HN蛋白突變改變了趨化因子的表達，這將為了解免疫與發(fā)病機制的關系提供信息，用于開發(fā)成調節(jié)HPIV3感染后過度活躍的炎癥反應的治療措施。

盡管關于人副流感病毒的HN蛋白研究報道已經(jīng)不少，也初步探索了該蛋白的功能及其在致病性上的作用。仍有許多方面有待進一步了解。尤其是為什么會需要一個為了促進起始融合的HN-受體的結合，HN蛋白受體結合后發(fā)生了怎樣的構象變化。了解HN蛋白如何執(zhí)行其F蛋白激活功能是理解副粘病毒怎樣進入宿主細胞的核心，也是進一步預防和控制兒童副流感病毒感染的潛在基礎，對病毒基于HN受體結合、激活病毒包膜與宿主細胞膜融合和入侵宿主細胞的每一步深入研究，都可能提供研發(fā)抗病毒新藥的靶標。

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