植物源活性天然提取物抗煙草花葉病毒的研究進(jìn)展

郭 亮，蔡海林，何命軍，謝鵬飛，張萬(wàn)良，梁棋政

（1.湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.長(zhǎng)沙市煙草公司寧鄉(xiāng)縣分公司，湖南 長(zhǎng)沙 410600）

煙草病毒病俗稱煙草花葉病，是煙草生產(chǎn)上的嚴(yán)重病害。煙草感染煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）后，葉片葉綠素被破壞，光合作用減弱，生長(zhǎng)受抑制，造成植株生長(zhǎng)困難，畸形、矮化，甚至導(dǎo)致死亡。由于病毒粒子是活體寄生，侵入寄主后，其核酸很快與寄主的核糖體結(jié)合，與寄主的代謝融為一體，不僅與寄主爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)成分，還破壞其寄主的相關(guān)組織細(xì)胞，借助寄主的代謝來(lái)復(fù)制病毒自身的蛋白，改變某些代謝平衡和一些酶的活性。煙草病毒病防治較為困難，導(dǎo)致煙草減產(chǎn)幅度為20%～80%，全球每年煙草花葉病毒造成的損失可達(dá)1億美元[1]。大多病毒對(duì)抗生素等藥物不敏感，且目前很難找到既抑制病毒又不損傷寄主的藥物，因此煙草病毒病的防治就成為困擾植物保護(hù)界的一大難題[2]。

植物體內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)，其次生代謝產(chǎn)物超過(guò)40萬(wàn)種，大多數(shù)物質(zhì)，如菇烯類、生物堿、類黃酮、酚類、氨基酸和多糖等均具有一定的殺蟲(chóng)抑菌作用。據(jù)相關(guān)報(bào)道，植物源抗病毒物質(zhì)的篩選主要集中在抗TMV方面[3]，目前已試驗(yàn)的有591種植物提取物對(duì)真菌或細(xì)菌有拮抗作用，173種植物提取物具有抗病毒作用[4]。該研究對(duì)植物源活性天然抑制劑的篩選方法和作用機(jī)理進(jìn)行了初步綜述，并對(duì)其存在的問(wèn)題和發(fā)展前景進(jìn)行了討論。

1 植物源抗煙草花葉病毒活性抑制劑的篩選方法

目前常用的植物病毒抑制劑的篩選方法是枯斑半葉法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（ELISA）。近年來(lái)科研工作者不斷完善植物病毒抑制劑的篩選方法，以避免藥物在抑制病毒的同時(shí)對(duì)植株寄主本身造成傷害。1996年江山等[5]研究發(fā)現(xiàn)，病毒在裝配過(guò)程中，病毒衣殼蛋白要先形成一定程度的多聚體，之后才能與病毒核酸進(jìn)一步裝配，形成完整的病毒粒體。運(yùn)用這一理論，發(fā)現(xiàn)了對(duì)TMV衣殼蛋白聚合作用的影響程度可以作為植物內(nèi)源抗病毒物質(zhì)的篩選方法之一。1997年李重九等[6]提出建立離體核酸核糖體反應(yīng)體系，通過(guò)對(duì)病毒RNA與寄主mRNA競(jìng)爭(zhēng)核糖體的系數(shù)來(lái)篩選藥劑，實(shí)驗(yàn)證明離體核酸核糖體反應(yīng)體系可以作為篩選植物病毒抑制劑的方法之一。2000年侯玉霞等[7]提出病毒/細(xì)胞高效同步侵染體系，運(yùn)用該體系研究了3種植物源提取物抗TMV的活性測(cè)定和對(duì)葉綠體的保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)不同抗病毒物質(zhì)進(jìn)行篩選，并進(jìn)行整株實(shí)驗(yàn)和大田實(shí)驗(yàn)，證明了病毒/細(xì)胞高效同步侵染體系在篩選植物病毒抑制劑方面具有可行性。

2 植物源活性物質(zhì)抗TMV等植物病毒的作用機(jī)理

煙草病毒具有生命周期，包括吸附、侵染、增殖、擴(kuò)散、裝配和釋放等過(guò)程。從理論上講，只要阻斷或限制煙草病毒生命周期中的某一環(huán)節(jié)，或者生命周期中參與的主要因子，就可以達(dá)到抑制病毒的效果。目前抗植物病毒的主要機(jī)理包括抑制病毒的侵染、病毒增殖和擴(kuò)散、病毒癥狀的表達(dá)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等。

2.1 抑制病毒的侵染

通過(guò)抑制TMV對(duì)寄主的侵染是目前植物源病毒抑制物發(fā)揮作用的主要途徑，這種抑制病毒侵染的作用方式一般有兩種，一種是直接鈍化病毒阻止其侵染，另一種是通過(guò)體外抑制直接或間接占據(jù)病毒侵染位點(diǎn)。

研究表明多數(shù)植物病毒抑制物是通過(guò)直接作用來(lái)抑制病毒的，將病毒暫時(shí)性或永久性地鈍化。如國(guó)內(nèi)廣泛使用的植物抗病毒劑NS-83，就是通過(guò)在體外鈍化TMV的活性來(lái)達(dá)到抑制TMV侵染的目的，它同時(shí)可以抑制病毒的增殖作用[8-9]。此外，還有些植物病毒抑制物通過(guò)破壞病毒的完整性來(lái)達(dá)到抑制病毒侵染的作用，比如萬(wàn)壽菊素和槲皮素，與TMV結(jié)合會(huì)引起病毒粒體形態(tài)改變，從而使病毒的侵染活性下降[10]。

病毒侵染植物，在寄主植物上必需有特定的識(shí)別位點(diǎn)，這些位點(diǎn)一般存在于植物寄主葉片上，阻止病毒與這些位點(diǎn)的結(jié)合，也是抑制病毒侵染的主要途徑之一。如硫脈基磷酞胺脂類化合物，可以吸附TMV病毒顆粒，使其不能與寄主植物上識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，從而達(dá)到抗病毒的效果；商陸中提取的蛋白質(zhì)PAP，與TMV結(jié)合可以降低TMV的侵染活性；雞冠花提取物可以抑制TMV形成枯斑，通過(guò)與病毒結(jié)合，使其無(wú)法發(fā)揮吸附作用[11-12]。此外，還有一些生物堿或黃酮類化合物，也可以通過(guò)鈍化病毒或占據(jù)病毒侵染位點(diǎn)來(lái)達(dá)到抑制TMV侵染的作用。

2.2 抑制病毒增殖和擴(kuò)散

在病毒侵染寄主植物后，病毒就能在寄主體內(nèi)進(jìn)行增殖和擴(kuò)散，這是個(gè)一系列的過(guò)程，包括脫殼、病毒核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成、病毒裝配和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移（體內(nèi)長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)）等環(huán)節(jié)?？梢葬槍?duì)這些環(huán)節(jié)中的某個(gè)或某些環(huán)節(jié)來(lái)抑制病毒增殖或擴(kuò)散，從而達(dá)到防治病毒病的目的。

現(xiàn)有的抗TMV的植物病毒抑制物有作用于抑制病毒的復(fù)制，如紫草提取蛋白PZ1，它的作用機(jī)制是抑制TMV-RNA合成和TMV-RNA與核糖體的結(jié)合，減弱病毒RNA與寄主RNA競(jìng)爭(zhēng)核糖體的機(jī)會(huì)，使原本與核糖體結(jié)合能力大大超過(guò)寄主RNA的病毒RNA選擇性的受到抑制，同時(shí)增強(qiáng)寄主mRNA的結(jié)合能力，從而抑制病毒核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。有部分植物病毒抑制物對(duì)病毒RNA復(fù)制及蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制或干擾，通過(guò)這種途徑來(lái)抑制病毒的增殖，如植物RIPs，就是使真核細(xì)胞核糖體失活來(lái)抑制病毒復(fù)制。也有植物病毒抑制物通過(guò)抑制或干擾病毒粒子的裝配過(guò)程，使病毒粒子不能完整的裝配，從而達(dá)到抑制病毒增殖的效果[13]。如商陸中提取的蛋白PAP，可以抑制TMV病毒衣殼蛋白合成，從而影響病毒粒子的裝配。植物抗病毒抑制劑VFB、WCT-II以及大蒜揮發(fā)油等通過(guò)干擾TMV外殼蛋白的聚合，發(fā)揮抑制病毒增殖的功能[14-15]。

此外，一些植物源的小分子物質(zhì)也可以通過(guò)抑制病毒的增殖來(lái)發(fā)揮抗TMV的作用[16-17]。

2.3 抑制病毒癥狀的表達(dá)

在煙草花葉病毒侵染寄主植物，增殖和擴(kuò)散后，就要在寄主植物上進(jìn)行表達(dá)，而這種表達(dá)在宏觀上看就是在植物上所表現(xiàn)的癥狀。一般來(lái)說(shuō)，在病毒進(jìn)行侵染、增殖后，會(huì)破壞植物細(xì)胞，特別是其中的葉綠體和葉綠素，使寄主植物表現(xiàn)出花葉、褪綠、壞死等癥狀。有些植物病毒抑制物從病毒癥狀的表達(dá)上來(lái)抑制病毒的危害，使植株健康生長(zhǎng)，如N-（2-苯并咪唑基）氨基甲酸甲脂，通過(guò)影響寄主植物激素含量或維持葉綠體含量來(lái)消除病害癥狀的發(fā)生，抑制病毒癥狀的表達(dá)。有些激素也可以抑制病毒癥狀的產(chǎn)生。如施用赤霉素來(lái)增加植株的產(chǎn)量，在TMV病毒含量不減少的情況下可以減輕癥狀，從而抵消病毒對(duì)產(chǎn)量帶來(lái)的不利影響[18]。李玉霞等報(bào)道一些植物病毒抑制劑夠抑制TMV對(duì)寄主植物葉綠體的作用，其作用機(jī)理可能是花葉癥狀嚴(yán)重程度與TMV外殼蛋白濃度正相關(guān)，在葉綠體中，葉綠體與TMV外殼蛋白結(jié)合會(huì)打斷光合作用中的電子傳遞鏈，這些病毒抑制劑通過(guò)抑制TMV對(duì)葉綠體的破壞，促進(jìn)寄主植物的光合作用。

2.4 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，以及各種檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，利用植物抑制物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)、穩(wěn)定、持久的抗病性，這將成為植物病理學(xué)研究的方向之一。對(duì)煙草的誘導(dǎo)抗性研究起步較早，以TMV為研究對(duì)象，已經(jīng)形成了相對(duì)比較系統(tǒng)的理論。一般來(lái)說(shuō)，在病毒侵染寄主植物后，植株本身會(huì)感受到病毒的存在，并通過(guò)內(nèi)源信號(hào)分子產(chǎn)生抗病毒信號(hào)，傳遞至整株植物，進(jìn)而激活寄主植物潛在的抗病基因，使植物發(fā)生一系列細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)變化，激活和誘導(dǎo)寄主植物系統(tǒng)抗性，抑制病毒侵染。

目前研究比較多的植物內(nèi)源信號(hào)分子為茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid SA）和乙烯（ethylene，Et）等[19-20]。關(guān)于誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒物質(zhì)，報(bào)道的主要有病程相關(guān)蛋白（PRs蛋白）、抗病毒因子（Anti-virusfactor，AVF）、水楊酸或過(guò)氧化物酶等。誘導(dǎo)植物合成PRs的原理是植物病毒抑制劑激發(fā)苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，將游離狀態(tài)的苯丙氨酸相繼轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸、香豆素、植保素、木質(zhì)素、單寧等，同時(shí)誘發(fā)合成相關(guān)酶和蛋白，參與抗病過(guò)程，起到防衛(wèi)反應(yīng)的作用。在TMV侵染下，一些抗病毒的物質(zhì)能誘導(dǎo)寄主植物中產(chǎn)生抗病毒因子，一般為含磷糖蛋白，具有抗病毒能力。除了一些植物源蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)以外，一些小分子物質(zhì)也可以作為病毒抗性誘導(dǎo)劑，如生物堿、萘醛、甾體、脂肪酸等[21-22]。

3 植物源抗病毒抑制劑在研究應(yīng)用中存在的問(wèn)題及前景

目前，在植物源抗病毒抑制劑的研究方面取得了一些進(jìn)展，但也存在一些問(wèn)題，主要集中在這幾個(gè)方面：一是篩選出的植物病毒抑制劑在抑制病毒的同時(shí)，也對(duì)寄主植物本身產(chǎn)生毒害作用。如目前廣泛使用的廣譜抗植物病毒劑——病毒唑，它對(duì)一些主要的植物病毒都有一定程度的防治效果，但對(duì)寄主植物本身也有不同程度的毒害作用。二是植物源抗病毒抑制劑的作用時(shí)間和范圍有限。至今已篩選出的植物源病毒抑制劑，大部分在植物組織的局部施藥都有一定的效果，但是作用的有效期短，不抗雨水沖刷，其中起作用的主要成分是堿基類似物或其前體類似物。三是植物源抗病毒抑制劑大多成分復(fù)雜，各成分在抗病體系中起到了不同的抑制作用，一般具有良好的病毒抑制效果，但易受環(huán)境因素影響，常導(dǎo)致藥效不穩(wěn)定。四是沒(méi)有建立一個(gè)簡(jiǎn)便、快速、完整的藥劑篩選及檢測(cè)體系，篩選方法還有待進(jìn)一步完善。

煙草病毒病發(fā)生日趨嚴(yán)重，抗病毒藥劑的研發(fā)和使用對(duì)于防治該病具有重要意義。目前，傳統(tǒng)的抗病毒制劑往往效果不佳，或者對(duì)植物有毒害作用。運(yùn)用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因抗病品種，如弱毒疫苗、衛(wèi)星核酸等又存在一定爭(zhēng)議，不容易被采納。植物源活性物質(zhì)抗病毒效果良好，其治療效果不亞于化學(xué)合成制劑，且資源豐富、綠色環(huán)保，在環(huán)境中一般不易降解，不會(huì)造成環(huán)境污染和殘留毒性問(wèn)題，具有廣闊的發(fā)展前景。

[1]Mcgrath M T，Shishkoff N E.valu ation of biocompatible products for managing cucurbit powdery mildew[J].Crop Protect，1999，18：471-478.

[2]翟梅枝.植物次生物質(zhì)的抗病活性及構(gòu)效分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2003.

[3]宋水方.植物病毒病的藥劑的防治研究 [J].世界農(nóng)業(yè)，1989，（9）：40-42.

[4]杜春梅，吳元華，趙秀香，等.天然抗植物病毒物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2004，10（l）：34-39.

[5]江 山，郭雪柳，韓熹萊.一些抗植物病毒劑對(duì)煙草花葉病毒衣殼蛋白體外聚合過(guò)程的影響[J].中國(guó)病毒學(xué)，1996，11（1）：77-79.

[6]李重九，侯玉霞，王蔚霞，等.植物病毒病選擇性治療藥劑的篩選研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，1997，27（4）：343-348.

[7]侯玉霞，李重九，張文吉.病毒/細(xì)胞同步侵染體系篩選抗植物病毒劑的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（3）：261-265.

[8]Mozes R，Antignus Y，Sela I，et a1.The chemical nature of an antiviral factor fAVF1 from virus-infected plants[J].Journal of General Virology，1978，38：241-249.

[9]雷新云，裘維蕃，于振華，等.一種病毒抑制物質(zhì)NS-83的研制及其對(duì)番茄預(yù)防TMV初侵染的研究 [J].植物病毒學(xué)報(bào)，1984，14（1）：1-7.

[10]Ouyang M A，Wein Y S，Zhang Z K，et a1.Inhibitory activity against tobacco mosaic virus（TMV）replication of pinoresinol and syringaresinol lignans an d their glycosides from the root of Rhus javanica vat.roxburghiana[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（16）：6460-6465.

[11]張付云，趙小明，白雪芳，等.殼寡糖誘導(dǎo)植物抗病性研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物防治，2008，24（2）：174-178.

[12]Baranwal V K，Verma H N.Localized resistance against virus infection by leaf extract of Celosia cristata[J].Plant Pathology，1992，41（5）：633-638.

[13]Tsutomu I，Youiehi T，Seiko I，et al.Formation of anti-plant viral protein by Mirabilis jalapa L.cells in suspension culttlre[J].Plant Cell Reports，1987，6（3）：216-218.

[14]陳啟建，劉國(guó)坤，吳祖建，等.大蒜精油對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，34（1）：30-33.

[15]陳啟建，劉國(guó)坤，吳祖建，等.大蒜揮發(fā)油抗煙草花葉病毒機(jī)理[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：24-27.

[16]譚慶偉.臭椿抗煙草花葉病毒活性物質(zhì)的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

[17]劉國(guó)坤，陳啟建，吳祖建，等.丹皮酚對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，35（1）：17-20.

[18]Mayer A.Concerning the mosaic disease of tobacco[J].Die Landwirtschaftliche Versuehsstationen，1886，32：451-467.

[19]Vlot A C，Klessig D F，Park S W.Systemic acquired resistance：the elusive signal （s）[J].Current Opinion in Plant Biology，2008，11（4）：436-442.

[20]Feys B J，Parker J E.Interplay of signaling pathways in plant disease resistance[J].Trends in Genetics，2000，16（10）：449-455.

[21]Li Y M，Jia Y T，Zhan g Z K，et a1.Purification and characterization of a new ribosome inactivating protein from Cinchonaglycoside C—treated tobacco leaves[J].Journal of Integrative Plant Biology，2007，49（9）：1327-1333.

[22]張正坤，沈建國(guó)，塒荔巖，等.鴉膽子素D對(duì)煙草抗煙草花葉病毒的誘導(dǎo)抗性和保護(hù)作用[J].科技導(dǎo)報(bào)，2008，26（8）：31-36.