泛素化在人表皮生長(zhǎng)因子受體降解中的研究進(jìn)展

李 燾綜述，劉朝奇，王雄偉審校

（三峽大學(xué):1.神經(jīng)病學(xué)研究所；2.分子生物研究所，湖北 宜昌 443003）

人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是原癌基因c－erBb－1的表達(dá)產(chǎn)物，其編碼的蛋白質(zhì)屬Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，由3部分組成:胞外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，包括EGFR、C－erbB－2、C－erbB－3、C－erbB－44個(gè)成員，EGFR 與配體結(jié)合而激活后，胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基自磷酸化轉(zhuǎn)為活性形式，誘發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑（如 PLC－γ、Ras、PI3K、JAK2），引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、放化療抵抗。泛素化介導(dǎo)的EGFR降解是下調(diào)其活化的一個(gè)常見(jiàn)機(jī)制［1］。本文對(duì)泛素化在EGFR降解中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 泛素－蛋白酶系統(tǒng)（UPS）

UPS是真核生物中必不可少的結(jié)構(gòu)，它可以控制包括蛋白激酶在內(nèi)的多種蛋白。泛素是小分子多肽，可以通過(guò)ATP依賴(lài)途徑激活，泛素與基質(zhì)蛋白的結(jié)合需要3個(gè)酶的參與:Ub活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）。E1主要活化Ub，E2與活化的Ub作用后通過(guò)E3連接酶與酶作用物結(jié)合，進(jìn)而促使了酶作用物的泛素化，E3連接酶HECT結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域2個(gè)獨(dú)特的類(lèi)型。具有HECT的E3連接酶與Ub結(jié)合形成硫酯鍵，進(jìn)而將E3連接酶直接轉(zhuǎn)移到酶作用物，具有RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶不與Ub結(jié)合形成硫酯鍵，它主要是作為適配器來(lái)促使E2結(jié)合酶與酶作用物結(jié)合，進(jìn)而促使泛素與酶作用物的結(jié)合［2］。c－Cbl是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶，可以通過(guò)指環(huán)結(jié)構(gòu)域與E2泛素結(jié)合酶結(jié)合，導(dǎo)致底物泛素化和降解。

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）與受體結(jié)合，磷酸化的c－Cbl補(bǔ)充到細(xì)胞膜表面，并通過(guò)TKB與活化的EGFR的Y1045結(jié)合，隨后共定位于核內(nèi)體和多泡小體中，E2泛素結(jié)合酶Ubc4／5與細(xì)胞膜上的c－Cbl協(xié)同作用，隨后進(jìn)入Hrs陽(yáng)性核內(nèi)體，提示EGFR在內(nèi)在化后被泛素化［3］。Frey等［4］發(fā)現(xiàn)，EGFR的泛素化需要EGFR激酶的活化和Y1045位點(diǎn)的磷酸化，此外，活化的P38也參與了此過(guò)程。在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤結(jié)構(gòu)性激活的EGFRvⅢ中，Y1045的突變抑制了Cbl－b介導(dǎo)的EGFRvⅢ的泛素化和信號(hào)下調(diào)，因此加強(qiáng)了EGFRvⅢ對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換能力［5］。

Huang等［6］通過(guò)質(zhì)譜分析法發(fā)現(xiàn)，EGF介導(dǎo)了EGFR激酶域中亮氨酸富集序列的泛素化，亮氨酸殘基在激酶域的突變可以阻止EGFR的泛素化和降解，Y1045的突變可以很大程度的減少但并不能消除這些殘基的泛素化，可能與E3連接酶或者非Y1045依賴(lài)性的c－Cbl的補(bǔ)充相關(guān)。Grb2可以與磷酸化的Y1068或者活化的EGFR的Y1068直接結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)SH3域與Cbl結(jié)合，補(bǔ)充Cbl到EGFR。Shc是具有Grb2的復(fù)合體，可以與EGFR中磷酸化的Y1148和Y1173相結(jié)合，Cbl也可能直接通過(guò)與Shc補(bǔ)充到EGFR［7］。

磷酸化的EGFR能夠被下游通路中的PKC所抑制，PKC介導(dǎo)的T654位點(diǎn)的磷酸化抑制了EGFR的磷酸化、泛素化及降解，使內(nèi)在化的EGFR循環(huán)回到細(xì)胞膜［8］。RALT與EGFR的結(jié)合可以抑制EGFR活性的下調(diào)，而跨膜蛋白LRIG1與EGFR和c－Cbl結(jié)合、ACK1與活化的EGFR的相互作用均可以促進(jìn) EGFR 活性的下調(diào)［7，9］。

EGF還可以激活EGFR的類(lèi)泛素化修飾，進(jìn)而加強(qiáng)隨后的泛素化和挑選EGFR進(jìn)行降解，EGFR的類(lèi)泛素化修飾與泛素化相互協(xié)調(diào)，加速了受體降解前的挑選［10］。此外，網(wǎng)格蛋白依賴(lài)性和脂筏依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用也參與了EGFR分子的泛素化，EGFR可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用內(nèi)在化，然后循環(huán)回到細(xì)胞表面，與此相反，EGFR通過(guò)脂筏依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用內(nèi)在化后優(yōu)先進(jìn)行降解［11］。

2 Cbl對(duì)EGFR的調(diào)節(jié)

Cbl家族中其他兩個(gè)成員Cbl－b和Cbl－3也參與促進(jìn)EGFR降解，活化的EGFR不僅可以降低Cbl－b及其酶作用物Shc和Grb2的降解，促進(jìn)了Shc和Grb2相互作用，還增強(qiáng)了Shc和Grb2在細(xì)胞膜的補(bǔ)充。目前研究認(rèn)為，有3個(gè)蛋白質(zhì)（Nedd4、Itch及HECTE3連接酶的 WW域）參與了早期的內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)，它們可以與Cbl－b結(jié)合并促進(jìn)其在蛋白酶體中的降解，Nedd4可以與Cbl－b結(jié)合并促進(jìn)其在蛋白酶體中的降解，翻轉(zhuǎn)Cbl－b對(duì)EGFR的泛素化和降解作用，并可以激活c－Src，因此提供了另一個(gè)對(duì)Cbl酶作用物的直接調(diào)節(jié)的機(jī)制［12］。

v－Cbl和70Z－Cbl是c－Cbl的兩個(gè)指環(huán)結(jié)構(gòu)缺陷的致癌突變體。v－Cbl是具有355個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，70Z－Cbl是缺乏17個(gè)內(nèi)在氨基酸的突變體，并且這17個(gè)內(nèi)在氨基酸與指環(huán)結(jié)構(gòu)存在部分重疊，指環(huán)域的突變可以導(dǎo)致E3連接酶的活性消失，但仍然不足以引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，與此相反，與SH2和指環(huán)結(jié)構(gòu)連接的高度保守的α螺旋結(jié)構(gòu)的突變促使了Cbl蛋白的致癌作用，這可能是通過(guò)破壞Cbl和Ubc的TKB域?qū)е翬GFR的泛素化和下調(diào)功能的缺失。Baldys等［13］發(fā)現(xiàn)，c－Cbl促進(jìn)雙調(diào)蛋白介導(dǎo)的EGFR循環(huán)回細(xì)胞膜，并介導(dǎo)了ERK1／2MAPK的磷酸化激活。此外，c－Cbl還可以通過(guò)上調(diào) MMp2的水平增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性［14］。

3 泛素化與早期內(nèi)吞作用

SH2結(jié)構(gòu)域和指環(huán)結(jié)構(gòu)在EGFR泛素化中扮演重要角色，c－Cbl具有聚脯精氨酸結(jié)構(gòu)的C端與CIN85（85×103長(zhǎng)度的c－Cbl相互作用蛋白）N端的SH3域結(jié)合，可以補(bǔ)充CIN85－內(nèi)吞蛋白復(fù)合體到活化的EGFR，內(nèi)吞蛋白通過(guò)SH3域與CIN85結(jié)合，在早期的內(nèi)吞作用中調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的內(nèi)陷，c－Cbl與Sprouty2的相互作用可以對(duì)EGFR進(jìn)行調(diào)整，Sprouty2與CIN85和c－Cbl構(gòu)成了一個(gè)三位復(fù)合體，阻止CIN85介導(dǎo)的c－Cbl的聚集及CIN85對(duì)EGFR泛素化的阻斷。Feng等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Sprouty2通過(guò)與c－Cbl共同作用增加EGFR的整體水平及磷酸化水平，進(jìn)而降低大腸癌細(xì)胞對(duì)EGFR靶點(diǎn)藥物gefitinib的敏感性。同樣，β－Pix的SH3域與Cdc42形成復(fù)合體，然后和CIN85一起與c－Cbl的脯氨酸精氨酸富集區(qū)結(jié)合，進(jìn)而抑制c－Cbl對(duì)EGFR負(fù)性調(diào)節(jié)功能，反之，c－Cbl促進(jìn)β－Pix的泛素化及降解［16－17］，此外，與CIN85相互作用的凋亡關(guān)聯(lián)蛋白ALG－2相關(guān)蛋白X（Alix）和具有UBA和SH3結(jié)構(gòu)的T細(xì)胞Ub配體（TULA）通過(guò)與CIN85或者c－Cbl結(jié)合抑制EGFR泛素化［18］。Wakasaki等［19］發(fā)現(xiàn)，CIN85可以促進(jìn) TGF－α介導(dǎo)的RAS及下游通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)HNSCC腫瘤細(xì)胞的增殖，而不影響EGFR的磷酸化水平。

Hrs和信號(hào)轉(zhuǎn)換銜接分子（STAM）是EGFR內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)因子，具有UIM域，Hrs與STAM共同作用并共同定位于早期核內(nèi)體膜表面。Hrs－STAM復(fù)合體可以通過(guò)識(shí)別活化的EGFR的Ub挑選受體，并促使挑選的受體從早期的核內(nèi)體進(jìn)入多泡小體中（MVB）。EGF激活作用上調(diào)后，Hrs的Y329和Y334位點(diǎn)以Cbl E3連接酶依賴(lài)性的方式出現(xiàn)磷酸化，促進(jìn)Hrs和EGFR的降解，Hrs或者STAM的刪除或者缺陷的哺乳動(dòng)物細(xì)胞抑制EGFR的降解［18］。去泛素化酶USP8與Hrs的作用相反，可以通過(guò)與STAM結(jié)合而減慢去泛素化過(guò)程，使得EGFR的降解減少［20］，而機(jī)體維持Hrs與USP8平衡的機(jī)制尚不清楚，可能與腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)。

4 泛素化與晚期內(nèi)吞作用

目前仍不完全清楚機(jī)體是通過(guò)何種機(jī)制精確調(diào)節(jié)EGFR的降解而不是回到細(xì)胞膜，研究認(rèn)為泛素與轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物（ESCRT）的相互作用在MVB的挑選過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

在酵母菌中，ESCRT－Ⅰ基因由Vps23、Vps 28及Vps37組成，Vps23是哺乳動(dòng)物易感基因Tsg101的同源體，ESCRT－1編碼產(chǎn)生一段350×103長(zhǎng)的保守蛋白復(fù)合體，可以短暫地從胞漿補(bǔ)充到核內(nèi)體膜上［1］，ESCRT－Ⅱ是由 Vps22、Vps25以及Vps36組成的復(fù)合體，編碼產(chǎn)生155×103的蛋白，ESCRT－Ⅲ是由2個(gè)功能性子復(fù)體構(gòu)成:一個(gè)由Snf7／CHMP4a和Vps20／CHMP6構(gòu)成的近膜子復(fù)體，另一個(gè)由Vps2／CHMP2a和Vps24／／CHMP3構(gòu)成的外圍關(guān)聯(lián)子復(fù)體，ESCRT－Ⅲ易位到核內(nèi)體的過(guò)程依賴(lài)于ESCRT－Ⅱ的參與［21］。

泛素化的EGFR被挑選進(jìn)入MVB首先由HRS（Hrs蛋白調(diào)控酪氨酸激酶ESCRT－0）觸發(fā)，HRS可以通過(guò)串聯(lián)泛素結(jié)合模體（UIM）與泛素化的EGFR結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)FYVE域與3磷酸磷脂酰肌醇結(jié)合后定位到核內(nèi)體膜。隨后HRS通過(guò)PSAP序列域召集ESCRT－1到核內(nèi)體膜上的著錨點(diǎn)，ESCRT－Ⅰ可以通過(guò)其組件中的TSG101中的UEV域識(shí)別泛素化的EGFR，ESCRT－Ⅱ可以通過(guò)其Vps36的Np14鋅指結(jié)構(gòu)（NZF）識(shí)別泛素化的EGFR，EGFR隨后通過(guò)ESCRT－Ⅲ復(fù)合體聚集，泛素則通過(guò)去泛素化酶DOA4移除，聚集的EGFR被挑選進(jìn)入MVB的囊泡中，ESCRT復(fù)合體通過(guò)ATP酶相關(guān)活性蛋白Vps4分離出來(lái)［22－23］。包括HIV在內(nèi)的多種病毒具有泛素化的GAG蛋白，可以與TSG101結(jié)合，進(jìn)而補(bǔ)充ESCRT到細(xì)胞膜表面，以及在MVB中通過(guò)同樣的方式引起病毒顆粒的出胞作用［24－25］。此外，AMSH、AMSH 結(jié)構(gòu)樣蛋白及其他的泛素分解酶（DUB）比如泛素特異蛋白酶8（DOA4的直系同源體），能夠在泛素化的EGFR進(jìn)入MVB之前將Ub殘基分離，從而促使Ub循環(huán)回到細(xì)胞質(zhì)［18，26］。目前仍不清楚DUB在內(nèi)吞作用中不同階段協(xié)同EGFR去泛素化的機(jī)制。

5 ErbB2、ErbB3、ErbB4與泛素化的關(guān)系

ErbB2的高表達(dá)與腫瘤的預(yù)后不良呈正相關(guān)。EGF、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和ErbB2特異性抑制性抗體都可以介導(dǎo)ErbB2的泛素化和降解，這些抗體與ErbB2結(jié)合后補(bǔ)充c－Cbl到ErbB2的Y1112位。Y1112的突變可以阻礙抗體介導(dǎo)的ErbB2的降解［27］。c－Cbl參與配體介導(dǎo)的EGFR家族蛋白的降解，這個(gè)過(guò)程需要EGFR蛋白的C端激酶活化和酪氨酸磷酸化，在配體依賴(lài)性機(jī)制中，只有受體所在部位的細(xì)胞膜被作為靶點(diǎn)，而ErbB2烷基化主要作用在位于EGFR核酸連接部位的半胱氨酸殘基［18］。ErbB2和Hsp90抑制劑可以調(diào)節(jié)UPS介導(dǎo)的早期的和成熟的ErbB2的降解，E3連接酶和CHIP也有可能參與調(diào)節(jié)這個(gè)過(guò)程［28］。此外，具有指環(huán)結(jié)構(gòu)域的Nrdp1可以激活ErbB3的泛素化和降解，Itch的過(guò)度表達(dá)可以通過(guò) WW域與ErbB4受體結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)其聚泛素化和降解，但是不能與EGFR、ErbB－2及 ErbB－3作用［18］。

6 展 望

EGFR的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、侵襲性、耐藥性及放療耐受相關(guān)，泛素化介導(dǎo)的EGFR降解是下調(diào)其活化的一個(gè)常見(jiàn)機(jī)制，泛素介導(dǎo)EGFR在細(xì)胞內(nèi)的降解機(jī)制尚不完全清楚，相信這些問(wèn)題的解決將有利于理解泛素化與EGFR相關(guān)性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系，進(jìn)而解釋泛素化在腫瘤研究中的前景。

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