MicroRNA在冠心病中的作用研究

蔣珽，項(xiàng)陽(yáng)

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210093)

MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)中非編碼蛋白質(zhì)的小RNA，約含18～22個(gè)寡核苷酸，在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性［1］。它通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)結(jié)合，抑制該 mRNA的翻譯過(guò)程，從而調(diào)控基因表達(dá)［1］。miRNAs在生物體的物質(zhì)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化與凋亡等一系列生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。目前在人類(lèi)基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約800種miRNAs，估計(jì)總共有超過(guò)1 000種miRNAs在人類(lèi)基因組中表達(dá)［2］。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)是心血管疾病中的常見(jiàn)病，具有高發(fā)病率和高致死率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人體健康。作者對(duì)miRNAs與冠心病的關(guān)聯(lián)以及miRNAs在冠心病的病因、診斷、治療方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNAs的發(fā)現(xiàn)

1993 年，Lee等［3］在研究線蟲(chóng)(C.elegans)發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)miRNA基因lin-4。Lin-4基因編碼22個(gè)核苷酸的單鏈RNA，在線蟲(chóng)發(fā)育早期，lin-4通過(guò)結(jié)合到mRNA Lin-14的3'-UTR，抑制Lin-14的蛋白表達(dá)。但此發(fā)現(xiàn)一直未能引起很多關(guān)注，直至2000年時(shí)，Reinhart等［4］在線蟲(chóng)中鑒定出另一個(gè)miRNA基因let-7，此時(shí)miRNA家族才迅速進(jìn)入人們視野，緊接著在擬南芥、果蠅、小鼠以及人類(lèi)等各種生物中都相繼有miRNA的報(bào)道。近年的研究表明，miRNA在一些疾病，例如心臟疾病和癌癥過(guò)程中扮演著重要的角色。因此有關(guān)miRNA的研究，對(duì)于醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)都有著非常重要的意義［5-6］。

2 miRNAs的生成及作用機(jī)制

首先攜帶miRNA信息的基因在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成一種較長(zhǎng)的初始轉(zhuǎn)錄RNA，即前體miRNA(pri-miRNA)，然后pri-miRNA會(huì)再被叫Drosh的RNA內(nèi)切酶Ⅲ剪切成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的70個(gè)堿基左右的RNA，即初級(jí) miRNA(pre-miRNA)。隨后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA會(huì)從載體蛋白中脫落下來(lái)，被一種叫做Dicer的RNA內(nèi)切酶Ⅲ剪切成22個(gè)堿基左右的成熟雙鏈miRNA。此雙鏈miRNA中的一條會(huì)被降解，另外一條5'端熱穩(wěn)定性較差的RNA將被特異性地整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中形成 miRISC，從而發(fā)揮生物學(xué)功能［7-9］。

我們通常認(rèn)為miRNA是通過(guò)下面的方式來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的:成熟miRNA單鏈的5'端有一個(gè)稱(chēng)為種子序列的7nt序列，它會(huì)結(jié)合在位于靶基因mRNA的3'UTR的蛋白編碼基因上并與之相互作用，識(shí)別靶mRNA。當(dāng)miRNA序列與靶基因mRNA的3'UTR完全匹配時(shí)，miRNA促使靶基因的mRNA發(fā)生降解;當(dāng)miRNA通過(guò)與3'UTR的不完全匹配結(jié)合，miRNA阻礙靶基因mRNA的翻譯，但不影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性［10］。

3 miRNAs與冠心病的關(guān)聯(lián)

近年來(lái)研究表明，miRNAs與心血管疾病緊密相關(guān)。其中miR-1和miR-133被發(fā)現(xiàn)與多種心臟疾病相關(guān)，miR-1、miR-133 有可能是心律失常的致病因子［11］，抑制miR-1和miR-133的表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌肥大［12］，且對(duì)心功能有保護(hù)作用［13］。而miR-21通過(guò)控制心肌間質(zhì)纖維化的范圍，對(duì)抗心力衰竭［14］。miRNA與冠心病也具有密切的關(guān)聯(lián):血管內(nèi)皮源性的miRNAs(miR-17、miR-26和miR-92a)在冠心病患者血漿中明顯低于非冠心病者;同樣活化的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)的miR-155在冠心病患者血漿中也明顯低于非冠心病者;相反，心肌源性的miRNAs(miR-133，miR-208a)則顯著高于非冠心病者［15］。Cheng等［16］發(fā)現(xiàn)通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的小鼠血清中miR-1水平與對(duì)照組相比在心梗后6 h升高了200倍，心梗3 d后miR-1降至正常水平，并且心梗小鼠血清中miR-1水平的升高與其心肌梗死面積呈正相關(guān)。同時(shí)，他們通過(guò)臨床研究還發(fā)現(xiàn)AMI患者血清miR-1水平與對(duì)照組相比在心梗后6 h升高了100倍，且其血清miR-1水平的升高與肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平的升高呈正相關(guān)［16］。Jing 等［17］發(fā)現(xiàn)AMI患者血漿miR-1水平顯著高于非AMI者，而在經(jīng)過(guò)2周的住院治療后miR-1下降回正常對(duì)照組水平。統(tǒng)計(jì)分析顯示，AMI患者血漿miR-1水平的升高與患者年齡、性別、血壓、是否合并糖尿病沒(méi)有關(guān)系，而與患者的QRS波變化相關(guān)。

另一方面，針對(duì)細(xì)胞中的 miRNA，Menno等［18］發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的miR-135a與未患冠心病的對(duì)照組相比升高5倍，而miR-147下降4倍，導(dǎo)致miR-135a/miR-147升高19倍(P＜0.001)。與此同時(shí)，通過(guò)miRNA目的基因的生物信息學(xué)分析提示冠心病患者的PBMCs中miRNAs的變化與細(xì)胞內(nèi)cadherin/Wnt信號(hào)改變有關(guān)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定型心絞痛患者 PBMCs中 miR-134、miR-370、miR-198較穩(wěn)定型心絞痛患者分別升高3.5倍、3.1倍和12倍。這一觀察結(jié)果提示，miRNAs能對(duì)心絞痛患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層，辨別出具有發(fā)生急性冠脈綜合征風(fēng)險(xiǎn)的人群。miRNAs不僅與冠心病關(guān)系密切，而且具有對(duì)不同冠心病類(lèi)型進(jìn)行臨床分型的潛能。另外冠心病患者并非所有的miRNAs都高于非冠心病患者，冠心病患者血漿中不同的miRNAs呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，造成這一現(xiàn)象的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 miRNAs與冠心病的病因

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成粥樣斑塊使血管管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧而壞死引起冠心?。?9］。粥樣斑塊的形成是慢性炎癥反應(yīng)的過(guò)程［20］，巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)后引發(fā)炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。有研究用oxLDL刺激人巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中miR-125、miR-9、miR-146和miR-155等表達(dá)異常。而生物信息學(xué)研究提示miR-125在oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)的攝取以及炎癥細(xì)胞因子分泌的減少［21］。MiR-126能夠抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激的血管黏附細(xì)胞因子1(VCAM-1)的表達(dá)，并限制白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附。已證實(shí)VCAM-1是miR-126的靶基因，敲除miR-126反義寡核苷酸可導(dǎo)致TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附［22］?？梢?jiàn)，miR-126具有調(diào)控黏附分子表達(dá)及血管炎癥反應(yīng)的功能，并能通過(guò)抑制VCAM-1的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程中起保護(hù)作用。

內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典刺激因素，而內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在維持內(nèi)皮的完整性以及內(nèi)皮細(xì)胞更新過(guò)程中起關(guān)鍵作用，冠心病患者循環(huán)系統(tǒng)中EPCs數(shù)量與年齡和性別相似的非冠心病患者相比降低，炎癥反應(yīng)及氧化機(jī)制致EPCs的數(shù)量和功能損傷性變化與心血管疾病啟動(dòng)、進(jìn)展和并發(fā)癥發(fā)生有關(guān)。EPCs數(shù)量減少導(dǎo)致血管炎癥，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、血栓形成，增加冠心病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)［23］。另有報(bào)道冠心病患者miR-221/miR-222的表達(dá)水平與EPCs數(shù)量的變化相反［29］。在球樣損傷的大鼠頸動(dòng)脈血管壁上miR-21的表達(dá)增加，而敲除miR-21可減輕血管內(nèi)膜病變。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)在已經(jīng)分化的血管平滑肌細(xì)胞中明顯高于剛分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞;敲除miR-21劑量依賴(lài)性地導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少、凋亡增加，并且這些結(jié)果都在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證［24］。細(xì)胞研究結(jié)果提示，抑制miR-21的功能可能具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

冠心病發(fā)生主要涉及血管內(nèi)皮功能和形態(tài)的損傷;細(xì)胞凋亡，內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積;單核細(xì)胞與內(nèi)皮黏附而進(jìn)入內(nèi)皮下并轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞吞噬脂質(zhì);血管平滑肌細(xì)胞增殖并向內(nèi)膜遷移，以及合成細(xì)胞外基質(zhì)等［25］。miRNAs在冠心病發(fā)病機(jī)制的各種因素中都有作用，無(wú)疑可為冠心病這一頑疾提供新的攻克方向。

5 miRNAs對(duì)冠心病的診斷

AMI是冠心病中的一類(lèi)高風(fēng)險(xiǎn)疾病，發(fā)病急，病情變化快，臨床上要求做到早期診斷、早期干預(yù)。要達(dá)到這一目的，必須有敏感性高、特異性強(qiáng)的心肌損傷標(biāo)記物作為診斷的工具。而近年來(lái)很多相關(guān)研究表明，循環(huán)miRNAs的表達(dá)水平及活性變化參與某些疾病病理過(guò)程，因其在檢測(cè)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在心血管疾病的診斷及治療中有非常重要的意義。Jing等［17］的研究發(fā)現(xiàn)miR-1有可能成為診斷AMI的特異性標(biāo)記物。他們用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析non-AMI和AMI病人的曲線下面積為0.774，而治療前后比較其曲線下面積達(dá)0.852。Xu等［26］通過(guò)靜脈注射異丙腎上腺素建立大鼠心肌缺血的動(dòng)物模型，然后用miRNA微陣列分析得出miR-208是心臟特異性的miRNA這一結(jié)果。同時(shí)他們?cè)诖笫蟊徽T導(dǎo)心肌缺血后不同時(shí)間段采血檢測(cè)血漿miR-208及肌鈣蛋白I(cTnI)，發(fā)現(xiàn)大鼠在心肌梗死后6 h內(nèi)，二者具有相似的時(shí)間變化趨勢(shì)。6 h以后兩者變化趨勢(shì)不同:其中miR-208呈逐漸下降趨勢(shì)，而cTnI則繼續(xù)升高。雖然如此，但miR-208在心梗后12 h相對(duì)于其本身的最初正常水平仍然顯著升高。這些結(jié)果提示，miR-208有可能成為一種新型心肌損傷標(biāo)記物，循環(huán)miRNAs表達(dá)譜可能成為冠心病的診斷標(biāo)記物。

Wang等［27］通過(guò) Northern Blot和 Real-Time PCR技術(shù)分析 4 種 miRNAs(miR-1、miR-133a、miR-499、miR-208a)在大鼠和人體不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在大鼠還是人體內(nèi)，正常狀態(tài)下檢測(cè)不到miR-208a，且只有受損的心臟組織中才能檢測(cè)到miR-208a。此外，他們通過(guò)切開(kāi)胸廓造成大鼠骨骼肌損傷，通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成大鼠心肌損傷，發(fā)現(xiàn)心肌損傷1 h內(nèi)大鼠血漿miR-208a即會(huì)明顯升高;如果未損傷心肌而只損傷了骨骼肌，則miR-208a不升高。而miR-1、miR-133a、miR-499不僅在損傷心肌時(shí)升高，在損傷骨骼肌時(shí)同樣會(huì)升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這4種miRNAs在心?；颊哐逯卸济黠@高于正常人以及其他患心血管疾病的病人;并且通過(guò)ROC曲線證明了miR-208a有很高的靈敏性和特異性，其曲線下面積達(dá)0.965。這些結(jié)果表明，miR-208a具有高度的心肌特異性。部分AMI患者接受冠狀動(dòng)脈介入治療和藥物治療2個(gè)月后復(fù)查，以上4種miRNAs與發(fā)病時(shí)相比均下降明顯，miR-208a含量下降至無(wú)法檢出的水平。而在另一方面，Wang等［27］發(fā)現(xiàn)在AMI發(fā)病早期4 h以?xún)?nèi)miR-208a即能夠被檢測(cè)到，而此時(shí)cTnI含量還在能被檢測(cè)到的閾值之下。研究者認(rèn)為大部分cTnI主要與肌原纖維結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅占2.8% ～4.1%，而miRNAs則在細(xì)胞質(zhì)中含量豐富，心肌細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致miRNAs釋放到血液中去。這提示miR-208a可能是一種有意義的早期AMI診斷的生物標(biāo)記物，對(duì)于早期接受手術(shù)治療挽救心肌有至關(guān)重要的意義。另外，有研究者也觀察了AMI發(fā)生早期外周血中全基因組的 miRNAs表達(dá)水平，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了121種miRNAs的表達(dá)有顯著變化，其中miR-1291和miR-663b區(qū)分病人和正常人的敏感性和特異性最高。研究還發(fā)現(xiàn)其中20種異常表達(dá)的miRNAs可以作為預(yù)診AMI的指紋圖譜，其診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為96%、90%、93%;另外miR-30c和miR-145與心肌梗死面積呈正比［28］。

上述結(jié)果提示，miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499等在心肌急性損傷過(guò)程中釋放異常增加，將來(lái)有可能成為一種繼肌鈣蛋白、肌紅蛋白及CK-MB后更早期診斷AMI的新型心肌標(biāo)記物。

6 miRNAs與冠心病的治療

從基因水平治療疾病是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。針對(duì)冠心病的治療目前臨床上除了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)外，還有他汀類(lèi)降脂藥、β受體阻滯劑等經(jīng)典藥物治療。而miRNAs能夠成為這些經(jīng)典藥物治療冠心病的靶點(diǎn)，使從基因水平治療冠心病成為現(xiàn)實(shí)。Minami等［29］研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者EPCs中的miR-221/miR-222顯著高于非冠心病者，而在冠心病患者中這兩種miRNAs的表達(dá)含量與EPCs的數(shù)量呈一定的負(fù)相關(guān)性。經(jīng)過(guò)12個(gè)月的治療，阿托伐他汀能夠降低冠心病患者EPCs中miR-221/miR-222的水平從而增加EPCs數(shù)量，使冠心病患者受益;而普伐他汀在治療冠心病患者時(shí)作用相對(duì)弱得多。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)運(yùn)用降脂與阿托伐他汀同時(shí)治療能顯著增加EPCs數(shù)量，降低miR-221/miR-222的水平，而這種治療方式在普伐他汀組中不能改變miR-221/miR-222的水平和EPCs數(shù)量。這一研究結(jié)果提示miRNAs能夠成為部分但并非所有他汀類(lèi)降脂藥治療冠心病的靶點(diǎn)。其他miRNAs是否也能成為他汀類(lèi)降脂藥的干預(yù)靶點(diǎn)尚不明確。此外，就干預(yù)miRNAs靶點(diǎn)進(jìn)行治療這條途徑而言，不同種類(lèi)不同劑量的他汀類(lèi)降脂藥對(duì)不同類(lèi)型的冠心病產(chǎn)生的療效如何也有待進(jìn)一步的研究。

經(jīng)典的β受體阻滯劑普萘洛爾是一種臨床上用于治療冠心病的常用藥物，尤其在預(yù)防AMI患者發(fā)生心源性猝死方面發(fā)揮重要作用。Yanjie等［30］通過(guò)研究說(shuō)明普萘洛爾可以降低因心肌缺血而引起的miR-1的表達(dá)增加，使之表達(dá)水平正常;并且普萘洛爾可以緩解心肌缺血時(shí)心肌損傷、膜去極化的修復(fù)及心臟傳導(dǎo)變緩。研究進(jìn)一步揭示心肌梗死大鼠體內(nèi)β腎上腺素能受體被刺激時(shí)會(huì)引起環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的升高，而后者再激活蛋白激酶 A(PKA)，進(jìn)一步刺激miR-1的表達(dá)。β腎上腺素能受體-cAMP-PKA信號(hào)通路在心臟諸多病理改變的過(guò)程中都很常見(jiàn)，而miR-1很可能與這些改變相關(guān)［30］。此外，miR-1的表達(dá)依賴(lài)于將血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)綁定于它的活化區(qū)域［31-32］。Yan等［30］發(fā)現(xiàn)使用異丙腎上腺素刺激大鼠β受體會(huì)引起SRF升高同時(shí)伴隨miR-1水平的升高。而心梗大鼠的SRF顯著升高且這種升高能夠被普萘洛爾所抑制。綜上所述，β受體阻滯劑通過(guò)阻斷β腎上腺素能受體-cAMP-PKA信號(hào)通路和抑制SRF表達(dá)這兩條途徑下調(diào)miR-1的表達(dá)，減少缺血性心律失常發(fā)生的幾率，從而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用。

7 展 望

miRNAs是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中新近發(fā)現(xiàn)的成員，近年來(lái)將其作為調(diào)控因子廣泛深入地研究，取得了諸多進(jìn)展。而冠心病是心血管疾病中的常見(jiàn)病，一直以來(lái)同樣被廣為研究。目前在冠心病領(lǐng)域的miRNAs研究取得了部分成果，在這一方面還有更多的研究拓展空間。首先，miRNAs影響冠心病病因的分子機(jī)制還有待更進(jìn)一步的闡明;其次，miRNAs對(duì)不同類(lèi)型的冠心病診斷價(jià)值如何，是否能夠在將來(lái)取代 cTnI、cTnT、CK-MB成為更優(yōu)異的心肌標(biāo)記物;最后，miRNAs是否能夠成為更多藥物干預(yù)的靶點(diǎn)從而達(dá)到治療冠心病的目的。綜上所述，miRNA在臨床診療冠心病方面的應(yīng)用仍需要不斷研究、探索、嘗試，最終才能實(shí)現(xiàn)。

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