黃瓜性別決定的分子機(jī)理研究進(jìn)展

趙志剛，柳美玲

（1 空軍司令部 南苑農(nóng)副業(yè)基地，北京 100076; 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

黃瓜(Cucumis sativus L)是世界十大蔬菜之一，是我國(guó)第一大保護(hù)地蔬菜作物，是農(nóng)村致富和農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2009年我國(guó)黃瓜栽培面積已達(dá)175.3萬公頃，總產(chǎn)量為2324.7萬噸，分別占我國(guó)蔬菜總播種面積和總產(chǎn)量的19.3%和15.6%，占同期全球黃瓜總量的64.9%和59.1%（FAOSTAT, 2009），栽培面積和總產(chǎn)量均占世界首位。但是，相對(duì)于世界發(fā)達(dá)國(guó)家如荷蘭、法國(guó)，我國(guó)黃瓜的單位面積產(chǎn)量低（我國(guó)黃瓜單位面積產(chǎn)量為13.3hg/hm，低于世界平均水平14.6萬hg/hm），產(chǎn)品品質(zhì)整體水平差，嚴(yán)重影響了黃瓜的出口量和農(nóng)民的收入。

新品種的培育是實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要原動(dòng)力，而全雌系或強(qiáng)雌系品種是黃瓜優(yōu)勢(shì)育種的重要途經(jīng)。黃瓜，由于其豐富多樣的性型表現(xiàn)而成為研究高等植物性別決定的模式植物[1]，黃瓜的性型包括雌雄異花同株(Monoecious)、純雌株(Gynoecious)、兩性株(Hermaphroditic)、雄花兩性花同株(Andromonoecious)以及三性株(Trimonoecious)[2]。其中，雌雄異花同株是最普遍的性別表達(dá)類型。在雌雄異花同株中，沿著主莖的花的發(fā)育可以分為三個(gè)階段:第一個(gè)階段是雄花形成階段，第二個(gè)階段是雌花和雄花均形成的混合階段，第三個(gè)階段是雌花形成階段。

本文綜述了黃瓜性別決定的最新分子機(jī)理研究進(jìn)展，旨在為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黃瓜雌性系品種提供理論基礎(chǔ)。

1 黃瓜的花

黃瓜的花包括單性花和兩性花，但是在發(fā)育早期，所有的花原基都包含四個(gè)輪生體，分別是萼片、花瓣、雄蕊和心皮，而單性花（雌花或雄花）的形成來自于黃瓜花發(fā)育過程中雄蕊或心皮的選擇性敗育[3]。有研究發(fā)現(xiàn)雄蕊的敗育主要發(fā)生在花藥原基，這種敗育與DNA的損傷密切相關(guān)[4]。通過對(duì)黃瓜花的同源突變體的研究表明，雄蕊或心皮發(fā)育的抑制依賴于輪生體的位置，而不是花器官的性別屬性[3]。在雄花中，心皮原基的敗育是先于花芽發(fā)育過程的第六階段子房的分化，而在雌花中，花藥和花絲的敗育發(fā)生在花芽發(fā)育第七階段花藥DNA降解之后[4]。

2 影響黃瓜性別的因素

黃瓜的性別決定是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種的因素影響，包括基因型、植物激素以及外界環(huán)境條件。

2.1 影響黃瓜性別的基因

黃瓜的性別主要受三個(gè)基因調(diào)控：F、M和A。F基因是半顯性的，其作用是加強(qiáng)雌性，促進(jìn)雌性較早發(fā)育，并使雌花向低節(jié)位發(fā)育[5]。M基因抑制雄花的發(fā)育，但不影響花在植株上的分布和排列。A基因抑制雌花發(fā)育，增強(qiáng)雄性，對(duì)F基因有上位效應(yīng)[6]。F、M和A三個(gè)影響黃瓜性別決定的主效基因相互作用產(chǎn)生各種不同的性別表型：全雌花基因型為F-M-AA/Aa/aa，雌雄異花同株為ffM-A-，雄花兩性花為mmffA-，兩性花為F-mmAA/Aa/aa，純雄株為ff MM/Mm/mm aa。

氨基環(huán)丙羧酸(ACC)合酶在黃瓜花芽分化過程中起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[7]，乙烯被認(rèn)為是黃瓜的“性激素”，它既促進(jìn)雌性的表達(dá)，也同時(shí)抑制雄性的表達(dá)。乙烯的合成途徑為甲硫氨酸-S腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)-ACC-乙烯[8]。其中，ACC合酶催化SAM形成ACC，是乙烯合成的主要限速酶，所以ACC合酶基因家族對(duì)黃瓜性型分化具有重要作用。

研究表明，F(xiàn)基因即Cs-ACS1G，它被認(rèn)為是由ACC合酶基因CsACS1新產(chǎn)生拷貝的上游序列與另外一個(gè)基因BCAT的部分區(qū)域重組而成[9]，從而改變基因的啟動(dòng)子區(qū)域。目前，Cs-ACS1和Cs-ACS1G的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被克隆[10]，這兩個(gè)序列都包含典型的啟動(dòng)子順式作用元件比如TATA盒子和CAAT盒子，另外，還包含一個(gè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的TGTCT元件。Cs-ACS1G是由Trebitsh等首先在黃瓜雌性系中發(fā)現(xiàn)的，而在鄰近的等基因的雌雄同株系中卻沒有[11,12]。2005年，陳惠明[6]等以不同性型的黃瓜為研究材料，通過針對(duì)CsACS1G基因設(shè)計(jì)的特異SCAR引物分析了CsACS1G基因與F基因以及雌性性狀之間的關(guān)系，并對(duì)CsACS1G進(jìn)行了定位結(jié)果也表明了Cs-ACS1G與Cs-ACS1基因的差異主要在啟動(dòng)子區(qū)。利用北京蔬菜研究中心構(gòu)建的黃瓜連鎖圖譜，成功將Cs-ACS1G基因特異的SCAR標(biāo)記定位在第10連鎖群上。隨后，程立寶等人克隆了Cs-ACS1G基因并對(duì)其進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)研究，表明Cs-ACS1G基因在黃瓜不同組織表達(dá)狀況不同，在根尖和莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)表達(dá)強(qiáng)，而在果實(shí)和腋芽中表達(dá)則很弱。因此，黃瓜Cs-ACS1G基因的時(shí)空表達(dá)模式存在差異[13]。

2009年，Li等利用圖位克隆的方法分離了黃瓜的M基因[14]。M基因編碼乙烯合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶CsACS2，該酶關(guān)鍵氨基酸的突變可導(dǎo)致兩性花變成單性花[14]，與甜瓜中抑制雄花發(fā)育的a基因類似[15]。有研究表明乙烯通過影響M基因的產(chǎn)物從而抑制黃瓜中雄蕊的發(fā)育[7]。CsACS2基因的表達(dá)主要集中在發(fā)育的雌蕊原基基部，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。另外，Cs-ACS2基因在雌雄同株和純雌株的莖尖以及黃瓜子房中表達(dá)。

陳惠明等鑒定了兩個(gè)新的黃瓜性別表達(dá)基因，分別命名為Mod-F1（不完全顯性）和mod-F2（隱性基因），二者均與F和M基因獨(dú)立遺傳，能夠增強(qiáng)黃瓜植株的雌性性狀的表達(dá)[16]。

目前，在黃瓜中，另外兩個(gè)ACC合酶基因CS-ACS3和CS-ACS4也已經(jīng)被克隆[17]。研究表明CS-ACS3基因受IAA誘導(dǎo)[6]，與Trebitsh[18]等報(bào)道的CS-ACS1和CS-ACS1G高度同源，可能是CS-ACS1G基因。但是，Kamachi等人發(fā)現(xiàn)，CS-ACS3基因表達(dá)量并不隨著黃瓜性別類型的改變而改變，認(rèn)為CS-ACS3基因與黃瓜的性別關(guān)系不大[2]。CS-ACS4基因的表達(dá)情況在兩性系和雄全同株系中沒有明顯的不同，但是在短日照（8h）比在長(zhǎng)日照(16h)下表達(dá)量高。

ACC氧化酶是乙烯合成中的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，ACC氧化酶基因CS-ACO1、CS-ACO2和CS-ACO3也被克隆，Kahana等通過RFLP分析純雌株與雌雄同株雜交的F2分離群體的結(jié)果表明F位點(diǎn)(locus)與Cs-ACO2之間的連鎖距離為8.7cM，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CS-ACO2和CS-ACO3的表達(dá)與黃瓜的雌性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[19]。有研究表明，被AP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的黃瓜基因Cs-ACO2在擬南芥中的過表達(dá)可以通過誘導(dǎo)染色質(zhì)的濃縮使擬南芥的雄蕊敗育，與黃瓜雌花發(fā)育過程中雄蕊的敗育是一致的[4,20]。乙烯受體基因也是乙烯信號(hào)傳遞途徑中的關(guān)鍵基因，黃瓜乙烯受體基因CS-ETR1、CS-ETR2、CS-ERS、CS-CTR、CS-EIN3、CS-EIL1、CS-EIL2、CS-ERF1、CS-EREBP等已被相繼克隆。研究表明，M/m基因或者其產(chǎn)物能夠通過控制CS-ETR2、CS-ERS等乙烯受體的表達(dá)而控制乙烯信號(hào)傳遞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)黃瓜性別的調(diào)控。如雌雄同株和純雌株莖尖中CS-ETR2和CS-ERS基因表達(dá)明顯受乙烯的誘導(dǎo)，而在雄全同株中受乙烯誘導(dǎo)的效果不明顯。同時(shí)，純雌株中CS-ETR2和CS-ERS的高表達(dá)量可能與純雌株內(nèi)源乙烯含量高有關(guān)，并在黃瓜雌性發(fā)育中起作用。

另外，黃瓜的性別發(fā)育還受MADS-box[21]基因家族調(diào)控，MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中序列特異的同源異型基因。它所編碼的MADS-box蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，在生物體中通過調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)來發(fā)揮其調(diào)控作用。上個(gè)世紀(jì)九十年代Coen和Meye．rowitz提出的ABC模型認(rèn)為：A、B、C這三類調(diào)控花器官特征的基因（其中絕大多數(shù)都是MADS-box基因）以聯(lián)合或單獨(dú)的方式來控制花器官的特征；A基因單獨(dú)控制萼片，A基因和B基因共同調(diào)控花瓣，B基因和C基因共同調(diào)控雄蕊，C基因單獨(dú)調(diào)控心皮，其中A基因和C基因的作用相互抑制。MADS-box基因家族包括黃瓜的AGAMOUS基因(CAG1,CAG2和CAG3)，CUCUMBER MADS1(CUM1)和CUM26，它們的基因表達(dá)隨著花的發(fā)育而出現(xiàn)階段性及組織表達(dá)特異性變化, 但不受外源赤霉素和乙烯的影響。ERAF17也是一個(gè)MADS-box基因[22]，但它在雌雄同株和全雌株中的轉(zhuǎn)錄時(shí)期和水平與乙烯利誘導(dǎo)雌花發(fā)育是一致的，因此，ERA F17可能介導(dǎo)乙烯誘導(dǎo)的雌花發(fā)育過程。

最近，Gu等人發(fā)現(xiàn)的CsCaN基因，具有乙烯誘導(dǎo)性和鈣依賴性，它在雌花發(fā)育的過程中參與了花藥原基特異性的DNA損傷，也與黃瓜的性別決定有關(guān)[23]。

2010年，Wu等人利用黃瓜的近等基因系材料全雌突變體Csg-G和兩性系Csg-M分離出了性別決定的有關(guān)基因，結(jié)果在突變體中發(fā)現(xiàn)了600個(gè)下調(diào)基因和143個(gè)上調(diào)基因[24]。并且，其中一些基因的表達(dá)與全雌突變體的組織部位以及花的發(fā)育階段有關(guān)。他們的研究表明了兩個(gè)方面的內(nèi)容：第一，差異表達(dá)的基因參與了植物激素信號(hào)傳遞途經(jīng)，比如ACS、Asr1、CsIAA2、CS-AUX1和TLP，暗示著植物激素以及它們的相互作用在黃瓜性別決定中起著關(guān)鍵作用；第二，一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，比如EREBP-9，可能也參與了黃瓜性別決定的過程。

2.2 植物激素與黃瓜性別的關(guān)系

除了性別決定的基因，植物激素也參與了黃瓜性別決定的過程。赤霉素和乙烯以及他們的抑制劑的施用能夠改變植物的基因型，赤霉素的作用主要是促進(jìn)雄性，而乙烯的作用主要是促進(jìn)雌性。通過對(duì)兩性系和雄全同株系的黃瓜處理不同組合的赤霉素和乙烯利，Yin和Quinn指出乙烯是主要的黃瓜性別決定的因素，而赤霉素可能是作為內(nèi)源乙烯產(chǎn)生的一個(gè)抑制因子[25]。這些發(fā)現(xiàn)讓他們提出了一個(gè)性別決定產(chǎn)生的模型：乙烯既能促進(jìn)雌性又能抑制雄性。這個(gè)模型的基本內(nèi)容是，F(xiàn)基因應(yīng)該能夠編碼一種物質(zhì)，這種物質(zhì)可以決定內(nèi)源乙烯在植株上的分布以及生成量，從而作用于植物體促進(jìn)雌性，而M基因也應(yīng)該能編碼一種對(duì)乙烯敏感的雄性受體因子，這種物質(zhì)能夠感知到乙烯信號(hào)而抑制雄蕊的發(fā)育。

乙烯被稱為是植物的“性激素”，其它激素生長(zhǎng)素和油菜素內(nèi)酯，被認(rèn)為是通過直接或間接影響乙烯的合成或信號(hào)傳遞，來實(shí)現(xiàn)對(duì)植物性別分化的調(diào)控[26,27]。

2.3 環(huán)境條件與黃瓜的性別決定

環(huán)境因素也影響黃瓜的性別分化，如短日照、低溫可以促進(jìn)雌花產(chǎn)生，而長(zhǎng)日照、高溫可以促進(jìn)雄花的產(chǎn)生[28]。

3 存在的問題及展望

在農(nóng)民生產(chǎn)栽培中，黃瓜經(jīng)常出現(xiàn)低雌花率甚至無雌花不能坐果，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量，因此培育穩(wěn)定的強(qiáng)雌或全雌性品種至關(guān)重要。然而至今除少數(shù)已克隆的性別分化基因外，精確的黃瓜性別決定機(jī)制并不清楚，這制約了通過基因工程手段培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的黃瓜。

從研究方法上看，黃瓜的性別決定研究主要通過同源比對(duì)克隆相關(guān)基因[13]，如乙烯合成和信號(hào)傳遞途徑基因，然后看其表達(dá)時(shí)間與部位；或通過分子標(biāo)記法[29-32]，尋找雌性系特異的基因表達(dá)，如11-1000。在基因表達(dá)水平上，Guo[33]等人利用454測(cè)序技術(shù)比較了雌性系WI1983G 和兩性系WI1983H花芽的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，并發(fā)現(xiàn)了214個(gè)基因有明顯的表達(dá)差異。但是，目前黃瓜的性別決定研究從取材和技術(shù)手段上都存在很大的局限性。例如，大多性別決定研究以整個(gè)植株或花器官為材料，它是大量的生長(zhǎng)、發(fā)育等下游基因累積作用后的最終結(jié)果，一定程度上忽視了對(duì)性別決定調(diào)控起關(guān)鍵作用的上游基因研究。并且，實(shí)驗(yàn)所用的差顯法和454測(cè)序技術(shù)，數(shù)據(jù)量和靈敏度都比較有限。

鑒于此，今后的研究方向可以利用新興的精確度和靈敏度都較高的技術(shù)比如激光捕獲顯微切割技術(shù)(Laser Microdissection)取樣[34,35]，實(shí)驗(yàn)材料采用黃瓜不同發(fā)育時(shí)期的幼嫩的花分生組織或者頂端分生組織[36,37]，尋找并克隆性別決定的上游基因，從分子發(fā)育學(xué)的角度，研究性別決定的分子機(jī)理，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黃瓜雌性系品種提供理論基礎(chǔ)。

另外，雖然黃瓜基因組[38]已經(jīng)公布，但是有關(guān)黃瓜轉(zhuǎn)錄組方面的信息仍然缺乏，今后可以從特定組織部位的轉(zhuǎn)錄組水平研究黃瓜的性別決定機(jī)制。

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