多發(fā)性腦梗死大鼠乳頭體一氧化氮合酶改變

張曄 張艷 周酈楠

心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病。全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居各種死因首位，它已成為人類死亡病因最高的頭號(hào)殺手。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多”即“四高一多”的特點(diǎn)，目前，我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人，每年死于心腦血管疾病近300萬(wàn)人，占我國(guó)每年總死亡病因的51%，且呈迅速上升趨勢(shì)。其中又以多發(fā)性腦梗死(Multiple Cerebral Infarction，MCI)的發(fā)病率占的比重最大。研究其發(fā)病機(jī)制、治療措施對(duì)提高人類生活質(zhì)量具有重要意義。

Papez回路已被普遍認(rèn)為參與認(rèn)知過程，包括記憶功能和空間短程記憶功能。此回路由海馬經(jīng)乳頭體(mammillary body)和前丘腦至扣帶回皮質(zhì)。其中乳頭體是下丘腦的重要組成部分，是海馬主要的輸出結(jié)構(gòu)。乳頭體病變時(shí)，可出現(xiàn)記憶力障礙、意識(shí)水平下降、情緒改變、癡呆及昏迷等癥狀［1］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多發(fā)性腦梗死大鼠乳頭體一氧化氮合酶的變化，以探討乳頭體與多發(fā)性腦梗死的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康成年Wistar大鼠40只，雄性，體重250～300 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，復(fù)合顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水和活動(dòng)。常規(guī)適應(yīng)環(huán)境5 d后，隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、缺血對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(術(shù)后4 h取材)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多發(fā)性腦梗死模型制備 按40 ml/kg體重注射1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，平甲狀軟骨高度做一偏左縱向切口，暴露左頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉處，并對(duì)境外動(dòng)脈進(jìn)行充分剝離。在頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，分別用顯微外科動(dòng)脈夾進(jìn)行無(wú)損傷夾閉。用顯微外科直剪在頸外動(dòng)脈上剪一斜口，由遠(yuǎn)心端向近心端插入靜脈留置針，結(jié)扎固定，拔出針芯，放開頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，推入肝素鹽水0.2 ml(含肝素10 U)，25 g/L同種屬大鼠全血懸濁液0.5 ml。注射完畢，立即將頸外動(dòng)脈剪口近心端處結(jié)扎，放開頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，觀察、逐層縫合［2］。

1.2.2 缺血對(duì)照組動(dòng)物模型制備 按40 ml/kg體重注射1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，平甲狀軟骨高度做一偏左縱向切口，暴露左頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉處，并對(duì)頸外動(dòng)脈進(jìn)行充分剝離。在頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，分別用顯微外科動(dòng)脈夾進(jìn)行無(wú)損傷夾閉。用顯微外科直剪在頸外動(dòng)脈上剪一斜口，由遠(yuǎn)心端向近心端插入靜脈留置針，結(jié)扎固定，拔出針芯，放開頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，推入0.7 ml生理鹽水。注射完畢，立即將頸外動(dòng)脈剪口近心端處結(jié)扎，放開頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，觀察、逐層縫合。

1.2.3 取材切片 大鼠經(jīng)1%肝素鈉生理鹽水、含4%多聚甲醛的0.1 m磷酸鹽緩液(PBS，pH=7.4)固定液內(nèi)固定灌注，取出腦組織并置于固定液中后固定4 h，然后將腦組織切成薄塊移入含20%蔗糖的0.1 m磷酸鹽緩液(pH=7.4)中4℃保存，至組織沉底，作冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。

1.2.4 尼氏染色 將冰凍切片吹干，用0.1 m磷酸鹽緩液(pH=7.4)漂洗3次(5 min/次)，將切片放入1%甲苯胺藍(lán)溶液(37℃)，90 min后取出用蒸餾水沖洗，再用0.1 m磷酸鹽緩液漂洗3次(5 min/次)，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

1.2.5 一氧化氮合酶組織化學(xué)染色 用0.1 m磷酸鹽緩液(pH=7.4)徹底漂洗切片;室溫下，在0.2%Tritonx-100PBS溶液中預(yù)孵育10 min;37℃下，在孵育液(NADPH-d 10 mg，NBT 5 mg，Tritonx-100 0.03 ml，用PH=7.4的0.1 m磷酸鹽緩液溶液配置成100 ml)中反應(yīng)2～3 h;用0.1 m磷酸鹽緩液(PH=7.4)終止反應(yīng)，并漂洗3次(1 min/次);常規(guī)脫水、透明、封片。

1.3 圖像分析 用Luzex-F顯微圖像分析儀測(cè)定大鼠乳頭體單位面積nNOS陽(yáng)性細(xì)胞及纖維的平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色結(jié)果 正常對(duì)照組和缺血對(duì)照組尼氏染色切片上，神經(jīng)元數(shù)量多，排列緊密，形態(tài)完整，泡漿內(nèi)尼氏體豐富。MCI4 h實(shí)驗(yàn)組大鼠乳頭體切片上，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮，有的呈空泡樣甚至溶解成碎片。

2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 MCI4 h實(shí)驗(yàn)組大鼠乳頭體神經(jīng)元有明顯改變:粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，呈裂隙狀或密集條紋;線粒體腫脹，嵴紊亂甚至缺失;核皺縮，核膜部分溶解、消失;突觸數(shù)量減少，前后膜融合，突觸小泡不清或出現(xiàn)聚集。根據(jù)尼氏染色和超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果證明MCI動(dòng)物模型制備成功。

2.3 NOS組化結(jié)果 光鏡下MCI大鼠乳頭體nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕褐色，多數(shù)為中小型細(xì)胞，胞體多呈卵圓形，突起較少。MCI 4 h實(shí)驗(yàn)組大鼠乳頭體切片上，正常神經(jīng)元數(shù)量減少，NOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞小，形態(tài)不同于正常NOS陽(yáng)性細(xì)胞。

2.4 圖像分析結(jié)果 MCI4 h實(shí)驗(yàn)組大鼠乳頭體nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與平均灰度值(43.09±3.95，183.69±3.80)均大于正常對(duì)照組(39.33±2.27，179.70±2.60)(P＜0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，MCI時(shí)，大鼠乳頭體NOS酶反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞及纖維數(shù)量顯著增多，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未見報(bào)道。一氧化氮(NO)是生物體內(nèi)的一種重要信使分子，參與腦的多種生理病理過程［3］。作為一種活潑的自由基，NO既能作為神經(jīng)信息分子發(fā)揮作用也可成為神經(jīng)毒性物質(zhì)。催化NO生物合成的酶稱為一氧化氮合酶(NOS)，是NO合成過程中的重要限速因素，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴于NOS的活性［4］。NO的半衰期很短，直接研究尚有困難，因此，對(duì)NOS的測(cè)定是深入研究NO生理病理作用的重要環(huán)節(jié)。NOS有三種亞型，即神經(jīng)元型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)及內(nèi)皮型(eNOS)，各型在腦組織中的分布以及在腦缺血中的作用各不相同［5］。有研究認(rèn)為，神經(jīng)元內(nèi)NOS主要是nNOS。

鼠類乳頭體位于正中，不像靈長(zhǎng)類等高等動(dòng)物的乳頭體左右成對(duì)酷似乳頭。乳頭體和海馬一樣也是腦內(nèi)易發(fā)生缺血的部位之一，進(jìn)化越高的組織對(duì)缺血的耐受性越差。乳頭體淺部覆有薄層白質(zhì)纖維，內(nèi)部含有數(shù)個(gè)核團(tuán)，分為乳頭體內(nèi)側(cè)核、乳頭體外側(cè)核、乳頭體前核、乳頭體后核及乳頭體上區(qū)。其中乳頭體內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元較易發(fā)生缺血改變，而外側(cè)核乳頭體內(nèi)側(cè)核組成卻較少發(fā)生。乳頭體內(nèi)側(cè)核組成乳頭體的主要傳導(dǎo)系統(tǒng)乳頭丘腦束和乳頭被蓋束，為其邊緣系統(tǒng)Papez環(huán)路的重要部分［6］。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用酶組織化學(xué)方法證明了MCI 4 h時(shí)，大鼠乳頭體NOS酶反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞及纖維數(shù)量顯著增多，結(jié)果提示NOS參與MCI的病理生理過程，可作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志物。

［1］劉鴻宇，藥宏亮，崔建梅，等.運(yùn)動(dòng)性疲勞對(duì)大鼠乳頭體表達(dá)的影響．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2009，25(1):381-382．

［2］周酈楠，張曄，張暉.CGRP對(duì)多梗死大鼠海馬CA4區(qū)NPY細(xì)胞影響的研究．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5(18):13-14．

［3］包新民，舒斯云，曾建新.大鼠全腦缺血后紋狀體邊緣區(qū)內(nèi)一氧化氮合酶、神經(jīng)肽Y表達(dá)的變化．第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(9):644-647．

［4］陳琳，高署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在腦缺血損傷中的作用．安徽醫(yī)藥，2004，8(1):3-6．

［5］Koh PO.Melatonin regulates nitric oxide synthase expression in ischemic brain injury．J Vet Med Sci，2008，70(7):747-750．

［6］童新，羅毅，張笑明，等.實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血乳頭體病理、神經(jīng)降壓素和生長(zhǎng)抑素改變及機(jī)制研究．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1992，9(4):193-195．