中藥鑒定方法的研究進(jìn)展①

劉淑蘭

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 哈爾濱 150000）

中藥鑒定是鑒別中藥的真?zhèn)?、?yōu)劣,質(zhì)量好壞的有效方法。傳統(tǒng)鑒定的方法即以四大鑒定(來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定)為主要方法。近20多年來,隨著對中藥研究的深人,現(xiàn)代化科學(xué)技術(shù)的滲透,中藥鑒定新技術(shù)得到了飛速發(fā)展,現(xiàn)將近20年來的中藥鑒定方法的內(nèi)容和應(yīng)用做一簡要綜述。

1 基原鑒定

基原鑒定是應(yīng)用植(動、礦)物的分類學(xué)知識,對中藥的來源進(jìn)行鑒定研究,確定其正確的學(xué)名,以保證應(yīng)用品種準(zhǔn)確無誤[1]。

1.1 經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)

傳統(tǒng)上中藥的物種分類鑒定和親緣關(guān)系的確認(rèn),一直運(yùn)用經(jīng)典的形態(tài)分類學(xué)方法,通過觀察植物形態(tài)、核對文獻(xiàn)和標(biāo)本,進(jìn)行原植物鑒定,確定正確的學(xué)名,以確保在應(yīng)用中品種準(zhǔn)確無誤。近年來我國學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量研究,取得了長足的進(jìn)展[2]為進(jìn)一步開展中藥研究提供根本保證。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

主要是利用細(xì)胞染色體資料來進(jìn)行分類的技術(shù)[3]。某個(gè)特定種群的生物體細(xì)胞中染色體的數(shù)目、形態(tài)、組型、帶型是穩(wěn)定不變的,代表著該種群的基本遺傳特征[4]。由于染色體形態(tài)只能在細(xì)胞分裂中后期觀察,因此該方法只適用于果實(shí)和種子類藥材鑒定,將其培養(yǎng)發(fā)芽后,取根尖制片,觀察并找到較好的染色體排列,制成核型模式圖。測定染色體長臂和短臂長度,計(jì)算同源染色體相對長度及臂長比值、著絲點(diǎn)指數(shù)、差值,求出核型公式,根據(jù)“不對稱核型分類”標(biāo)準(zhǔn)確定其核型,與已知該植物染色體的背景資料比較,確定藥材種屬[5]。該方法已被用于中藥梔子等的鑒定。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)是從分子水平研究生物體的生命活動及其規(guī)律的一門科學(xué),其應(yīng)用于中藥品質(zhì)鑒定領(lǐng)域,為中藥鑒定提供了一個(gè)嶄新的研究思路。分子水平一般有蛋白質(zhì)肽譜、同功酶譜及及DNA圖譜。目前應(yīng)用于中藥鑒定的主要有以下三類。

1.3.1 電泳技術(shù) 中藥電泳鑒別法是根據(jù)動植物類藥材中所含有的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、生物堿和酶等.其電荷性、電荷數(shù)和分子量各不相同,在電場作用下,經(jīng)一定時(shí)問,各成分泳動的方向、速度和距離也不相同,結(jié)合譜帶條數(shù)和染色結(jié)果的差異,達(dá)到分離鑒別的目的。電泳技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于中藥品質(zhì)鑒定中。通過聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜鑒別莧科6種種子類藥材[6]。

1.3.2 免疫技術(shù) 不同的動植物藥材含有不同的特異蛋白,利用該特異蛋白為抗原制各的特異抗體與檢品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)來鑒別藥材的真?zhèn)螢槊庖哞b別。該技術(shù)適用于動物藥材的鑒別,尤其是親緣關(guān)系比較接近的動物藥間的鑒別[7]。郭月秋等[8]根據(jù)這一技術(shù)原理,對鹿心及其偽品進(jìn)行鑒別,此方法快速而準(zhǔn)確。

1.3.3 DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù) DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)是直接分析生物的基因型來鑒別藥材。DNA分子標(biāo)記技術(shù)因目前應(yīng)用的主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)以及DNA測序等技術(shù)。在目前絕大多數(shù)動植物中藥材DNA序列尚不清楚的情況下,比其他分子標(biāo)記更有廣闊的前景。DNA分子標(biāo)記已經(jīng)有許多應(yīng)用,如對金銀花藥材[9]、郁金[10]、當(dāng)歸和大黃種子[11]的鑒別。

2 顯微鑒別

顯微鑒別是利用顯微鏡來觀察中藥粉末所具有的器官構(gòu)造、組織構(gòu)造碎片、細(xì)胞形狀以及內(nèi)含物的特征,以此來鑒別制劑的處方組成以及藥材真?zhèn)?。楊穎[12]對牛黃及其偽品進(jìn)行了顯微鑒別,天然牛黃可見不規(guī)則團(tuán)快,內(nèi)有黃棕色或紅棕色小顆粒集成的類方形晶體,遇水合氯醛色素迅速融解并顯明金黃色,久置變綠色。偽品均無天然牛黃的特征。

3 理化鑒別

理化鑒別是針對中藥所含主要學(xué)成分或有效成分,采用物理或化學(xué)方法進(jìn)行鑒別,包括熒法、顯色法、沉淀法、升華法、結(jié)晶法等。一般用于性狀相似又無明顯顯微鑒別特征且化學(xué)成分不同的藥材。馬洪梅[13]巴戟天及其偽品羊角藤進(jìn)行了理化鑒別,出現(xiàn)不同的熒光澤。林苗[14]等對山豆根及其混淆品朱砂根進(jìn)行了理化鑒別,二者顏色變化及沉淀行為均有不同。

4 現(xiàn)代鑒別方法

4.1 色譜鑒別

色譜鑒別是指使用薄層色譜、氣相色譜、液相色譜和連用技術(shù)對中藥進(jìn)行鑒別。

4.1.1 薄層色譜法 薄層色譜(TLC)鑒別可以在一塊層析板上容納多個(gè)樣品及出現(xiàn)多個(gè)信息,適合于天然藥物特別是中成藥組成成分復(fù)雜的情況,它具有分離和鑒定的雙重作用。徐列波[15]等采用薄層色譜法成功鑒別了赤芍及其偽品地榆。結(jié)果顯示,地榆在赤芍苷對照樣品相應(yīng)的位置上不具斑點(diǎn)。

4.1.2 氣相色譜法 氣相色譜法(GC)可以分析氣體及有一定揮發(fā)性的液體和固體樣品。郭曉玲[16]等采用氣相色譜法,對高要、石牌、吳川、遂溪、雷州及海南萬年產(chǎn)廣藿香揮發(fā)油進(jìn)行GC圖譜的比較分析,建立了廣藿香揮發(fā)油的特征指紋圖譜,可用于廣藿香的品質(zhì)控制及產(chǎn)地鑒別。沈振鐸[17]等采用氣相色譜法對26批五味子藥材進(jìn)行測定,通過南、北五味子GC指紋圖譜差異可以很容易地將它們相互區(qū)別開來。

4.1.3 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)作為一項(xiàng)高效、快速的分離分析技術(shù),在中藥領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用,幾乎所有的中藥有效成分均可進(jìn)行HPLC分離分析,是中藥指紋圖譜研究的常用手段。運(yùn)用梯度洗脫和二極管陣列監(jiān)測器,還可以得到分辨率高的三維色譜圖,因而可以較全面地檢測中藥材中多種成分分布的全貌。李正國[18]等使用高效液相色譜法對半夏水提物進(jìn)行了檢測,確定了9個(gè)峰作為鑒別半夏藥材與半夏替用品和偽品的群體特征峰,為半夏藥材的鑒定提供了重要參考。陳閩軍[19]等用高效液相色譜法獲得川芎藥材的色譜圖,從中提取15個(gè)色譜峰可用作指紋特征,結(jié)果表明不同產(chǎn)地川芎的指紋圖譜存在明顯差異,可用于川芎藥材的產(chǎn)地鑒別。

4.2 光譜鑒別

光譜鑒別的基本原理是利用中藥光譜學(xué)行為的不同,記錄其光譜用于鑒別。其常用方法有:紫外檢測法、紅外光譜法、近紅外光譜法、質(zhì)譜法、X射線衍射法等。

4.2.1 紫外光譜法 紫外鑒別是將中藥進(jìn)行提取,對其提取液采用紫外測定法對中藥進(jìn)行評價(jià)。趙駿[20]等利用紫外法測定了不同生長期及不同產(chǎn)地荷葉中荷葉堿的含量,為荷葉的質(zhì)量評價(jià)提供了依據(jù)。

4.2.2 紅外光譜法 紅外光譜法是將中藥粉末或其不同極性溶劑提取物采用壓片法或涂片法在紅外光譜區(qū)進(jìn)行測定得到紅外光譜,根據(jù)圖譜差異進(jìn)行鑒別。周欣[21]等采用采用傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)分析鑒別了7個(gè)不同產(chǎn)地的陳皮揮發(fā)油,其指紋特征可作為陳皮道地藥材的一種簡單、快速的鑒別依據(jù)。張韜[22]等建立了勝紅薊不同提取物的紅外光譜鑒別法。結(jié)合勝紅薊中含揮發(fā)油、黃酮及各種苷類的紅外特征將光譜圖分為3個(gè)區(qū)段，試驗(yàn)結(jié)果表明用極性不同溶劑提取的藥材其提取物與藥材殘?jiān)募t外光譜在這3個(gè)區(qū)段有顯著的差異。

4.2.3 近紅外光譜法 近紅外光指可見光譜區(qū)到中紅外光譜區(qū)之間的電磁波,譜區(qū)范圍為780～2526nm(12820-3959cm-1),其光譜信息來源于分子內(nèi)部振動的倍頻與合頻吸收,并且主要反映分子中C-H,N-H,O-H基團(tuán)的倍頻和合頻振動吸收。丁念亞[13]等應(yīng)用近紅外漫反射光譜分析技術(shù)對幾種常見中藥建立了一種簡單、快速、有效的分類和真?zhèn)舞b別方法。

4.2.4 質(zhì)譜法及聯(lián)用技術(shù) 質(zhì)譜法是在真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子,并通過對生成離子的質(zhì)量和強(qiáng)度測定,而進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。趙陸華[24]等采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法對13個(gè)產(chǎn)地烏骨藤指紋圖譜的相似度研究,評價(jià)了不同產(chǎn)地烏骨藤的質(zhì)量。張語遲[15]等通過HPLC-ESI-MS指紋圖譜對中藥西洋參與北沙參進(jìn)行了鑒別，方法簡單準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，具有實(shí)用價(jià)值。

4.2.5 X射線衍射法 X射線衍射法是利用各藥材的相組成、成分各不相同,被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象,產(chǎn)生特有的衍射圖譜的方法對中藥進(jìn)行鑒定的方法。張漢明[26]等對200多種中藥和成藥進(jìn)行分析,得到較滿意的結(jié)果。但是衍射法的應(yīng)用對于成分和晶型均為相同或極少差異的藥材鑒別仍然比較困難,故有其專用范圍。

4.2.6 廣義二維相關(guān)光譜法 廣義二維相關(guān)光譜法是指對一般光譜進(jìn)行相關(guān)性分析,得到光譜的二維尺度信息,包括同步相關(guān)光譜和異步相關(guān)光譜。對于一個(gè)待分析體系,對其施加一個(gè)外部微擾,則體系會產(chǎn)生一個(gè)動態(tài)的變化,其光譜行為就會發(fā)生變化,運(yùn)用相關(guān)分析對其譜圖進(jìn)行處理,可得到二維相關(guān)光譜。JunLu等[27]等將廣義二維相關(guān)光譜應(yīng)用于4個(gè)產(chǎn)地枸杞藥材的鑒別,說明其能區(qū)分重疊嚴(yán)重的近紅外光譜,發(fā)現(xiàn)中藥的近紅外特征,為枸杞提供一種便捷直觀的鑒別方法。劉浩[28]等應(yīng)用二維相關(guān)近紅外光譜分析方法,借助于計(jì)算機(jī),將近紅外光譜從一維拓展到二維,研究了變溫過程中香加皮的近紅外指紋圖譜,并與五加皮進(jìn)行了比較,代替了繁瑣的色譜指紋圖譜等傳統(tǒng)分析手段,實(shí)現(xiàn)了快速無損鑒別。

5 蛋白電泳法鑒別

高效毛細(xì)管電泳fHPCE)是近年發(fā)展起來的新技術(shù),具有高效、快速、樣本體積小和分析范圍廣闊等優(yōu)點(diǎn)。王德先[29]用此技術(shù)較容易的鑒別了天麻及其4種偽品。該方法也適于氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿及動物類藥材的鑒別。

6 免疫法

不同的動植物藥材含有不同的特異蛋白,免疫鑒別即利用該蛋白制備的特異抗體與待檢品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)來鑒別藥材的真?zhèn)?。該技術(shù)適用于動物藥材的鑒別,尤其是親緣關(guān)系比較接近的動物藥間的鑒別[30]。國內(nèi)學(xué)者[31]采用免疫電泳法及瓊脂免疫擴(kuò)散法準(zhǔn)確鑒定了虎、豹等多種動物的骨骼,還能將豹骨進(jìn)一步鑒定為雪豹、石豹或金錢豹,說明免疫鑒別方法是一種特異性很強(qiáng)的鑒別法。

7 指紋圖譜法

中藥指紋圖譜技術(shù)[32]是指某中藥材或中成藥中所共有的,具有特征性的某類或幾種成分的色譜或光譜的圖譜。即用一定的方法(如HPLC、GC、TLC、HPLC-MS、GC-MS、FTIR、x-ray和UV等),對特定的對象(如中藥材、提取物、飲片、注射液等)和過程進(jìn)行分析。得到的有特征性的相對穩(wěn)定的圖譜。其最大的特點(diǎn)就是通過指紋圖譜的特征性,有效鑒別樣品的真?zhèn)?。目前使用最多的中藥化學(xué)指紋圖譜是采用HPLC法[33],可提供大量的信息。符合中藥復(fù)雜體系研究的需要。

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