抗菌肽在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

丁 雪，劉顯軍

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）最早由瑞典科學(xué)家Boman等[1]用大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶分離獲得，是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的分子質(zhì)量較小，可以抵抗外界病原體侵害的，具有廣譜殺菌活性的一類(lèi)堿性多肽，也是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分?？咕氖巧矬w為適應(yīng)環(huán)境、求得生存而產(chǎn)生的免疫活性分子，具有選擇性效應(yīng)和無(wú)抗原性[2]。抗菌肽的作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素完全不同，不易產(chǎn)生耐藥性，只對(duì)原核細(xì)胞和病變的真核細(xì)胞起作用，而對(duì)正常的真核細(xì)胞無(wú)影響。隨著抗生素的限用，抗菌肽以其獨(dú)特的殺菌機(jī)理作為新一代綠色抗微生物添加劑，在養(yǎng)豬生產(chǎn)上有著廣泛的應(yīng)用前景。

1 抗菌肽的理化特性及結(jié)構(gòu)

大多數(shù)抗菌肽具有熱穩(wěn)定性，在100℃中加熱10～15 min仍能保持活性。多數(shù)抗菌肽表現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)離子特性，對(duì)較大的離子強(qiáng)度和較高或較低的pH，均具有較強(qiáng)的抗性。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)了具有陰離子特性的抗菌肽類(lèi)型，其作用機(jī)制與陽(yáng)離子抗菌肽也不十分相同[3]?？咕耐ǔＪ怯?2～60個(gè)氨基酸組成，其N(xiāo)-末端富含賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸等陽(yáng)離子型氨基酸，其C-末端富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸，而中間部分則富含脯氨酸。因此，大多數(shù)抗菌肽都是陽(yáng)離子型的，通常帶有2～7個(gè)正電荷，等電點(diǎn)大于7[4]。另外，一些天然抗菌肽的C-末端往往呈酰胺化結(jié)構(gòu)，這可能與其廣譜抗菌的活性有關(guān)。它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)分4種類(lèi)型，即β-折疊、兩親性α-螺旋、擴(kuò)展片層和環(huán)狀結(jié)構(gòu)；三維構(gòu)象可歸納為2種，即由疏水面和極性陽(yáng)離子面相對(duì)而成的兩性結(jié)構(gòu)和由正電荷區(qū)支托疏水核心組成的翅狀結(jié)構(gòu)[5]。所有抗菌肽分子在二級(jí)結(jié)構(gòu)上都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，那就是其分子中的疏水部分與陽(yáng)離子氨基酸部分分別位于分子結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域，形成了一個(gè)親分子的結(jié)構(gòu)，即與水和脂類(lèi)物質(zhì)都具有親和力的結(jié)構(gòu)，這也是抗菌肽發(fā)揮抗菌作用的基礎(chǔ)[6]。

2 抗菌肽的分類(lèi)及來(lái)源

抗菌肽來(lái)源十分廣泛，從病毒、細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及哺乳動(dòng)物等生物均有發(fā)現(xiàn)[7]。目前已從動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、植物與原核生物中分離到750多種抗菌肽。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有1 200多種?？咕牡姆诸?lèi)方法有多種：根據(jù)氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特征可分為4類(lèi)，即天蠶素、防御素、蛙皮素（富含脯氨酸）和蜂毒素（富含甘氨酸）；根據(jù)其作用對(duì)象的不同，抗菌肽可以分為抗細(xì)菌肽、抗真菌肽、抗腫瘤肽，既抗細(xì)菌又抗真菌的抗菌肽，既抗腫瘤又抗微生物的抗菌肽等類(lèi)型。根據(jù)其來(lái)源不同又可將抗菌肽分為哺乳動(dòng)物抗菌肽、兩棲類(lèi)動(dòng)物抗菌肽、昆蟲(chóng)抗菌肽、植物抗菌肽、細(xì)菌抗菌肽和病毒抗菌肽等[8]。

3 抗菌肽的生物活性及作用機(jī)理

3.1 廣譜抗菌活性及作用機(jī)理

抗菌肽具有廣譜高效的抗菌活性[9-10]，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用，還對(duì)真菌、原蟲(chóng)也有廣泛的殺菌活性。如天蠶素在25～100 mg/L時(shí)對(duì)曲霉菌屬和鐮刀菌屬的病原菌有殺滅作用[11]。并且它的抗菌濃度小，抗菌濃度單位一般在μmol/L水平?？咕牡姆N類(lèi)不同，其抗菌活性和抗菌譜有著很大差異。如在抗菌肽天蠶素A、B和D中，天蠶素A、B對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌（特別是革蘭氏陰性菌）有較大的殺傷力，而天蠶素D只對(duì)大腸桿菌有高效的溶菌活性[12-13]?？咕牟粌H自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽之間以及抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素之間具有協(xié)同作用，兩者聯(lián)用可提高抗菌肽和傳統(tǒng)抗生素的藥物療效，甚至拓寬傳統(tǒng)抗生素的抗菌譜。在抗菌肽的抗菌作用機(jī)制研究中，普遍認(rèn)為抗菌肽分子可在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔形成離子通道，造成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,引起細(xì)胞內(nèi)水溶物質(zhì)滲出,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[14-15]。

3.2 抗病毒作用及其機(jī)理

研究表明，抗菌肽有抗病毒活性[16]。抗菌肽的抗病毒功能，可影響從核酸復(fù)制到病毒顆粒包裝的全過(guò)程?？咕目赏ㄟ^(guò)與病毒外膜的直接結(jié)合發(fā)揮作用，例如，蛙皮素類(lèi)抗菌肽和人的嗜中性粒細(xì)胞防御素（HNP-1）對(duì)皰疹病毒-HSV的抗病毒作用[17]。抗菌肽能抑制病毒的繁殖，如蜂毒素和天蠶素A在亞毒性濃度下通過(guò)阻遏基因表達(dá)來(lái)抑制HIV-1病毒的增殖[18]?？咕倪€可模仿病毒粒子干擾其組合。在蜂毒素對(duì)煙草花葉病毒TMV抑制作用的研究中，發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列和蜂毒素序列存在相似性，而這部分序列在病毒顆粒組裝中與RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合密切相關(guān)。這樣蜂毒素蛋白分子可以偽裝成病毒包被蛋白，參與病毒合成，導(dǎo)致病毒顆粒無(wú)法正常組裝[19]。

3.3 抗腫瘤活性

抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害。這可能是因?yàn)檎婧思?xì)胞的質(zhì)膜中含有豐富的膜蛋白和膽固醇，細(xì)胞中發(fā)達(dá)的微絲、微管與質(zhì)膜結(jié)合，使得細(xì)胞膜比較穩(wěn)定。正因?yàn)檎婧思?xì)胞有如此發(fā)達(dá)的細(xì)胞骨架，才不會(huì)被抗菌肽所溶解。但是，某些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，抗菌肽可以插入癌細(xì)胞質(zhì)膜，使雙分子層發(fā)生融解，腫瘤細(xì)胞的完整性被破壞，細(xì)胞膜上形成的孔洞使內(nèi)容物外泄，線粒體出現(xiàn)空泡化、嵴脫落、核膜破損、界限模糊不清、核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成[20-22]。天蠶素、爪蛙素等表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞如纖維瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等的殺傷作用。

4 抗菌肽在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1 抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用

飼料中長(zhǎng)期添加抗生素類(lèi)促生長(zhǎng)添加劑會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株、環(huán)境污染等嚴(yán)重后果。天然抗菌肽來(lái)源于動(dòng)植物體，具有廣譜抗菌作用，對(duì)畜禽具有抑菌促生長(zhǎng)的功能，屬無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的一類(lèi)環(huán)保型飼料添加劑。動(dòng)物體內(nèi)的抗菌肽能抑制外源性病原菌的侵害，而對(duì)動(dòng)物腸道存在的正常菌群和細(xì)胞無(wú)害。雖然腸源抗菌肽有選擇性殺傷病原菌的優(yōu)點(diǎn)，但其在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)分泌量卻十分有限，很難以對(duì)動(dòng)物自身的保健起很大作用[23]。因此，研究開(kāi)發(fā)抗菌肽作為飼料添加劑對(duì)促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、推動(dòng)綠色畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽在仔豬斷奶應(yīng)激期間抗腹瀉效果較抗生素好，適量的抗菌肽比抗生素的促生長(zhǎng)效果更理想。但高劑量的抗菌肽降低了仔豬的生長(zhǎng)速度[24]。皮燦輝等（2008）研究認(rèn)為，使用抗菌肽制劑6個(gè)月，能顯著提高母豬的豬瘟抗體水平，對(duì)母豬的生產(chǎn)性能及免疫功能有改善作用[25]。李波等在母豬分娩前30 d到產(chǎn)后21 d添加400 mg/kg天蠶素抗菌肽，發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽能夠提高母豬的繁殖性能和仔豬的生長(zhǎng)性能等。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，母豬產(chǎn)前30 d和產(chǎn)后21 d添加400 kg/mg的天蠶素抗菌肽的上述指標(biāo)均高于添加抗生素的對(duì)照組，說(shuō)明在這個(gè)生產(chǎn)階段，天蠶素抗菌肽代替抗生素是可行的[26]。研究表明，在斷奶仔豬日糧中添加抗菌肽，結(jié)果表明添加0.3%天蠶素抗菌肽能夠提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能、促進(jìn)腸道菌群平衡、改善血清生化指標(biāo)、提高機(jī)體免疫力并減少應(yīng)激，從而促進(jìn)豬健康生長(zhǎng)[27]。應(yīng)用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明，柞蠶抗菌肽可減輕斷奶仔豬腹瀉[28-29]。

4.2 抗菌肽的藥用價(jià)值及其在豬病防治中的作用

仔豬腹瀉、豬瘟、藍(lán)耳病、豬瘟、圓環(huán)病毒2型感染、偽狂犬病及豬流感等疾病嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。長(zhǎng)期廣泛地使用抗生素，導(dǎo)致有效劑量不斷加大，用藥成本急劇上升。在劑量不斷加大的同時(shí)，也增加了動(dòng)物性食品抗生素的殘留，嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的健康?？咕淖鳛樘娲股氐男滦退幬?，在畜禽疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。汪以真等（2004）將抗菌肽與抗生素在體外對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌ATCC25922、豬霍亂沙門(mén)氏菌ATCC500、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌ATCC25923的效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，抗生素抗金黃色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但對(duì)大腸桿菌的效果要差得多[30]。

5 抗菌肽的基因工程研究

抗菌肽天然產(chǎn)量很低，從生物體內(nèi)分離抗菌肽不僅步驟繁瑣，產(chǎn)率較低，而且合成抗菌肽的價(jià)格又相當(dāng)昂貴。因此，利用基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)抗菌肽具有廣闊的發(fā)展前景，它為抗菌肽的制備提供了新的途徑。目前，多種抗菌肽已在不同的表達(dá)體系中得到表達(dá)。但如何進(jìn)一步提高表達(dá)水平，提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性和廣譜抗菌性，都是值得深入研究的問(wèn)題。Yang等在2004年將人的陽(yáng)離子抗菌肽hCAD-18/LL-37、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)和硫氧還蛋白建構(gòu)成表達(dá)載體pET-mh-CAD-18，然后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得的融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后形成重組的GSLL-39，重組的GSLL-39與其天然形式相比，在N末端多出2個(gè)氨基酸殘基，但與其天然形式相似，具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的活性[31]。賴(lài)玉平等于2004年將從人汗腺中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽DCD-1L基因克隆到畢赤酵母載體pPIC9中，并在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了表達(dá)。結(jié)果表明，GS115系統(tǒng)所表達(dá)的DCD-1L在pH 5.5～7.4范圍內(nèi)，具有抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性[32]。這些研究結(jié)果為基因工程獲得的抗菌肽作為飼料添加劑或直接口服等應(yīng)用的可能性提供了理論依據(jù)。

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