生物鑒定法在中藥鑒定中的應(yīng)用及前景

吳伯英

生物鑒定法是近年來(lái)興起的一種中藥品質(zhì)鑒定新方法，它和傳統(tǒng)的基原鑒定法、性狀鑒定法、顯微鑒定法、理化鑒定法一起，并稱(chēng)為中藥的五大鑒定法。生物鑒定法具有先進(jìn)性、適用性、可操作性和專(zhuān)屬性強(qiáng)等特征，并且能夠突出中藥的藥效學(xué)作用，準(zhǔn)確性高。

生物鑒定(bioassay)法又稱(chēng)“生物檢定”或“生物測(cè)定法”。是利用中藥或其所含的化合物對(duì)生物體(organism)的作用強(qiáng)度，以及用DNA特異性遺傳標(biāo)記特征和基因表達(dá)差異等來(lái)鑒別中藥的品種和質(zhì)量的一種方法。通常分為生物效應(yīng)鑒定法和基因鑒定法兩大類(lèi)。生物效應(yīng)鑒定法是利用藥物對(duì)于生物(整體或離體組織)所起的作用，測(cè)定藥物生物活性(biological activity)強(qiáng)度或藥理作用，以鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的方法。該法以藥理作用和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)方法和病理模型，通過(guò)被測(cè)物與相應(yīng)的對(duì)照品在一定條件下比較其產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量比例，測(cè)出藥物的活性作用。常用的方法有免疫鑒定法、細(xì)胞生物學(xué)鑒定法、生物效價(jià)測(cè)定法、單純指標(biāo)測(cè)定法、DNA遺傳標(biāo)記鑒定法、mRNA差異顯示鑒定法等[1]。

1 生物鑒定法

1.1 免疫鑒定法

免疫鑒定法是利用中藥含有的特異蛋白為抗原制備的特異抗體，與供試品中特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的一種方法，可準(zhǔn)確地鑒別中藥品種。不同的動(dòng)植物藥材含有不同的特異蛋白，免疫鑒別即用該蛋白制備的特異抗體與待檢品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)來(lái)鑒別藥材的真?zhèn)蝃2]。該技術(shù)適用于動(dòng)物藥材的鑒別，尤其是親緣關(guān)系比較接近的動(dòng)物藥間的鑒別[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用免疫電泳法及瓊脂免疫擴(kuò)散法準(zhǔn)確鑒定了虎、豹等多種動(dòng)物的骨骼，還能將豹骨進(jìn)一步鑒定為雪豹、石豹或金錢(qián)豹，說(shuō)明免疫鑒定方法是一種特異性很強(qiáng)的鑒別法[4]。免疫鑒定法還可以采用酶標(biāo)法和單克隆抗體法進(jìn)一步深入研究[5]。有待成為動(dòng)物類(lèi)中藥材鑒定中的主流技術(shù)。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)鑒定法

細(xì)胞生物學(xué)鑒定法主要采用染色體的分類(lèi)技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行鑒別。中藥某個(gè)特定種群的生物體細(xì)胞中染色體的形態(tài)、組型是穩(wěn)定不變的，代表該種群的基本遺傳特征，根據(jù)該特征即可鑒定中藥的品種，適用于果實(shí)和種子類(lèi)中藥的鑒定，將需鑒定的藥材培養(yǎng)發(fā)芽后，取根尖制片，觀察并找到較好的染色體排列，制成核型模式圖。測(cè)定染色體長(zhǎng)臂和短臂長(zhǎng)度，計(jì)算同源染色體相對(duì)長(zhǎng)度及臂長(zhǎng)比值、著絲點(diǎn)指數(shù)、差值，求出核型公式，根據(jù)“不對(duì)稱(chēng)核型分類(lèi)”標(biāo)準(zhǔn)確定其核型，與已知該植物染色體的背景資料比較，即可確定藥材種屬。該方法已被用于中藥梔子等的鑒別[6]。

1.3 生物效價(jià)測(cè)定法

生物效價(jià)測(cè)定(estimation of biological potency)法就是測(cè)定藥物對(duì)生物機(jī)體某方面作用的強(qiáng)度。如黃柏、黃連、黃芩等具清熱功效中藥的抑菌率或抗菌效價(jià)(titer)的測(cè)定，對(duì)洋地黃強(qiáng)心指標(biāo)生物效價(jià)的測(cè)定等。生物效價(jià)測(cè)定法是利用生物體的反應(yīng)來(lái)鑒定中藥有效成分的含量或效價(jià)，測(cè)定藥物的療效和毒性(toxicity)的方法。有些中藥，如洋地黃及其制劑，鈴蘭毒苷及其注射液，到目前為止還沒(méi)有找到一種比較合適的化學(xué)分析方法來(lái)確定它們的有效成分含量或效價(jià)。所以，就宜用生物檢定法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。生物效價(jià)測(cè)定的主要原則是將供試品與對(duì)照品(包括中藥、純成分)在嚴(yán)格規(guī)定的條件下，比較它們對(duì)生物體所產(chǎn)生的反應(yīng)強(qiáng)度，再計(jì)算出中藥或其制劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)。中藥的效價(jià)通常以1g中藥中所具有的“作用單位”數(shù)來(lái)表示。這種單位是指在一定條件下所表現(xiàn)一定生理作用的最小劑量。例如，2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定洋地黃制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]：洋地黃葉(Folium Digitalis)要保證同樣洋地黃制劑的各種商品的效價(jià)一致，而并不是為了使不同的精制強(qiáng)心苷效價(jià)相等。因?yàn)檫@種方法不能把它在腸內(nèi)吸收的差別，作用的快慢以及效力的久暫等估計(jì)在內(nèi)。鑒于現(xiàn)尚缺乏可靠的定量法，故可利用動(dòng)物試驗(yàn)以檢定藥物的效力。此種生物檢定法包括蛙法，貓法，豚鼠法及鴿法等。王盛民等[8]以穿心蓮對(duì)照藥材為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)穿心蓮藥材和含穿心蓮的中成藥進(jìn)行生物檢定，為其質(zhì)控方法進(jìn)行了生物檢定法研究，方法可行。

1.4 純指標(biāo)測(cè)定法

單純指標(biāo)測(cè)定法就是測(cè)定某藥物或某類(lèi)藥物某一特性或某一藥理作用的強(qiáng)弱。如對(duì)含皂苷類(lèi)中藥溶血指數(shù)的測(cè)定，如使用溶血法鑒定柴胡和大葉柴胡[9]；對(duì)含苦味中藥苦味指數(shù)的測(cè)定；對(duì)含蒽醌類(lèi)大黃的瀉下作用的測(cè)定；對(duì)青黛中靛玉紅，兩頭尖中竹節(jié)香附素A的抗癌活性的測(cè)定；黃芪中黃芪皂苷甲，三七中三七皂苷降血壓和擴(kuò)張血管作用的測(cè)定；對(duì)人參中人參多糖，刺五加根中刺五加多糖和紅花多糖的免疫作用的測(cè)定；對(duì)三七抗凝血作用的測(cè)定等。

1.5 DNA遺傳標(biāo)記鑒定法

DNA分子是由G、A、C、T 4種堿基(base pairs)構(gòu)成，為雙螺旋結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)鏈分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列序列中，遺傳上的差異便表現(xiàn)在4種堿基排列順序的變化之中，這就是生物的遺傳多樣性。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來(lái)鑒別物種就是DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別。在DNA分子上，有編碼與物種密切相關(guān)的基因區(qū)域，不十分密切相關(guān)的基因區(qū)域和非編碼基因區(qū)域。DNA遺傳標(biāo)記：這些基因區(qū)域在生物進(jìn)化過(guò)程中所受的壓力不同，前者所受選擇壓力大，表現(xiàn)出高度的保守性；后者所受選擇壓力小，表現(xiàn)出較大的差異性。正是這種壓力的不同，使得DNA分子的不同區(qū)域有不同程度的遺傳多樣性。因此可以選擇適當(dāng)?shù)腄NA分子遺傳標(biāo)記，在科，屬，種，亞種，居群和個(gè)體上對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行鑒別。

DNA遺傳標(biāo)記鑒定中藥的主要方法：DNA序列測(cè)定法，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA指紋分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，任意引物PCR反應(yīng)技術(shù)(arbitrarily primed PCR，AP-PCR)，限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，PCR擴(kuò)增特定片斷的限制性位點(diǎn)分析等方法[10～11]。黃豐等[12]對(duì)西紅花及其5種偽品進(jìn)行鑒定，并證明 RAPD對(duì)于應(yīng)用在干燥的植物類(lèi)生藥的鑒定上有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。張西玲等[13]利用特異性引物對(duì)當(dāng)歸、大黃種子中rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行套式 PCR擴(kuò)增，并將其堿基序列測(cè)定，結(jié)果顯示當(dāng)歸、大黃種子 rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的堿基序列具有明顯的差異和可對(duì)比性 ，不同植物中藥材種子 rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)堿基序列可作為從分子水平進(jìn)行鑒定的標(biāo)記。劉中權(quán)等[14]采用根據(jù)22種亞洲產(chǎn)龜類(lèi)的線粒12SrRNA基因片段序列，設(shè)計(jì)一對(duì)專(zhuān)用于鑒定中藥材龜甲原動(dòng)物龜?shù)蔫b別引物，用該對(duì)引物擴(kuò)增從烏龜和其他 18種龜48個(gè)樣品的 DNA模板。結(jié)果：在 72℃的復(fù)性溫度下進(jìn)PCR，4個(gè)烏龜?shù)哪０?DNA均得到約180bp的陽(yáng)性擴(kuò)增而其他各龜?shù)哪０錎NA，在同樣條件下無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。用對(duì)鑒別引物經(jīng)1次 PCR反應(yīng)便可準(zhǔn)確地鑒定受試原動(dòng)是否為烏龜。Fushimi等[15]采用PCR2RFLP方法對(duì)人參屬3種植物人參、西洋參和竹節(jié)參進(jìn)行了核基因組18S-rRNA片段分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ban和Dde I酶解的指紋圖譜較易將其區(qū)別開(kāi)來(lái)。

1.6 mRNA差異顯示鑒定法

mRNA差異顯示鑒定法是利用中藥不同組織或細(xì)胞在基因表達(dá)(gene expression)上的差異進(jìn)行鑒定的一種方法。它通過(guò)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA(complementary DNA)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分離出不同分子大小的DNA，挑選出有差異的表達(dá)基因進(jìn)行序列分析。既可以制備探針用于穩(wěn)定靈敏的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，也可以制備其蛋白產(chǎn)物及其抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。采用該技術(shù)，可以提煉出栽培和野生，道地和普通藥材等之間的特征，可望廣泛用于中藥的品種和質(zhì)量鑒定[10～16]。

2 討論

中藥生物鑒定法側(cè)重中藥的品質(zhì)和臨床用藥的安全性、有效性等的有機(jī)結(jié)合的研究，可以配合其他鑒定方法綜合解決中藥品質(zhì)鑒定的難題，并嘗試為中醫(yī)與中藥現(xiàn)代化的結(jié)合找到突破口。

中藥的品種鑒定和質(zhì)量控制是中醫(yī)藥研究的基礎(chǔ)，選擇最佳的方法、手段鑒定和評(píng)價(jià)中藥是新藥開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)。生物鑒定法目前在中藥鑒定領(lǐng)域已有很大的應(yīng)用，但目前此方法尚處于起步階段，在具體實(shí)施中相關(guān)方法和技術(shù)還有待于進(jìn)一步完善。但我們相信這種方法在不久的將來(lái)一定會(huì)成為鑒定和評(píng)價(jià)中藥的重要手段。

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