基于光源調(diào)制技術(shù)的金標(biāo)試紙條定量分析儀器

王 洋，蔣 凱，王 萍，韓紀(jì)昱

（浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程及儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027）

金標(biāo)免疫層析技術(shù)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析技術(shù)等多種技術(shù)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)便、快速，且具有很高的異性和敏感性，已廣泛應(yīng)用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）、鼠疫、乙肝、寄生蟲(chóng)、艾滋病等臨床檢測(cè)中[1]。金標(biāo)免疫試紙條檢測(cè)目前主要停留在定性判斷，應(yīng)用范圍受到很大限制。定性判斷容易受人為因素的干擾，且靈敏度低，可能出現(xiàn)“假陽(yáng)性”與“假陰性”，而且在臨床上不能建立該待檢指標(biāo)的動(dòng)態(tài)過(guò)程[2-3]。因此，研究試紙條的定量測(cè)試儀器具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)膠體金試紙條的定量測(cè)試進(jìn)行了一系列研究，光電檢測(cè)技術(shù)是普遍采用的檢測(cè)方案，但是信號(hào)的接收部分存在多種設(shè)計(jì)方案，各有優(yōu)弊。采用光敏電阻測(cè)量方案，電路簡(jiǎn)單、測(cè)量光強(qiáng)范圍廣，但是光敏電阻在測(cè)量中存在嚴(yán)重的阻值漂移，影響測(cè)量精度；采用CCD、CMOS等圖像傳感器測(cè)量顯色區(qū)域，雖然避免了設(shè)計(jì)機(jī)械掃描機(jī)構(gòu)，但是后期對(duì)圖像的分析處理同樣復(fù)雜，而且這種方案成本較高，難以在市場(chǎng)上推廣。本文設(shè)計(jì)的儀器采用綠光LED作為發(fā)射光源，以光電二極管接收試紙條反射光，并通過(guò)步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)掃描試紙條待檢區(qū)域，從而快速、準(zhǔn)確讀取膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果。但由于檢測(cè)系統(tǒng)不可能處于完全黑暗的環(huán)境，必然會(huì)受到環(huán)境的噪聲干擾。對(duì)此，本儀器還通過(guò)控制光源信號(hào)的調(diào)制及接收信號(hào)的解調(diào)過(guò)程，使光電傳感器只對(duì)特定頻率光信號(hào)敏感，從而消除了光譜的背景光及環(huán)境電磁干擾，提高了儀器系統(tǒng)檢測(cè)精度。

1 金標(biāo)免疫試紙條定量檢測(cè)原理

金標(biāo)免疫層析技術(shù)原理是：將特異性抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端滴入樣品（可取血、尿、唾液）后，由于滲透作用，樣品沿著纖維膜移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)生顯色。纖維素膜上一般有兩條線(xiàn)：檢測(cè)線(xiàn)（簡(jiǎn)稱(chēng)T線(xiàn)）和對(duì)照線(xiàn)（簡(jiǎn)稱(chēng)C線(xiàn)）。結(jié)果判定：如果檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)均顯色，則為陽(yáng)性，表明樣品中含有待檢物；如果僅對(duì)照線(xiàn)上顯色而檢測(cè)線(xiàn)未顯色，則為陰性結(jié)果，即未檢測(cè)到目標(biāo)物質(zhì)；如果對(duì)照線(xiàn)上未顯色，則無(wú)論檢測(cè)線(xiàn)上是否顯色，都認(rèn)為此次檢測(cè)失敗。如果樣品中含有待檢物，則檢測(cè)線(xiàn)會(huì)顯色，而且樣品中目標(biāo)待測(cè)物的含量越高，顯色會(huì)越深[1，4]。

根據(jù)吸光度原理，物體顏色的深淺和光的吸收與反射有關(guān)。顏色越深，則對(duì)光的吸收越強(qiáng)，反射的光強(qiáng)就越弱。因此，目標(biāo)待測(cè)物的濃度和檢測(cè)帶的反射光強(qiáng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在待檢物一定濃度內(nèi)，可認(rèn)為反射光強(qiáng)與其濃度成線(xiàn)性關(guān)系?；谝陨显恚ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)墓怆姍z測(cè)方法測(cè)量出反射光強(qiáng)，就可計(jì)算出目標(biāo)待測(cè)物的濃度[3-5]。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

金標(biāo)免疫試紙條分析儀主要由機(jī)械掃描模塊、光路模塊、電路控制模塊、輸入輸出模塊組成，如圖1所示。電路控制模塊控制LED光源發(fā)出中頻光信號(hào)照射到試紙條上，然后驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)，以帶動(dòng)機(jī)械掃描模塊移動(dòng)。光電二極管接收掃描得到的試紙條上反射的光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換成電信號(hào)后送入電路控制模塊進(jìn)行處理。該系統(tǒng)外擴(kuò)微型打印機(jī)、LCD、SD卡等輸出設(shè)備，處理后得到的檢測(cè)結(jié)果可被即時(shí)打印出來(lái)或者由LCD顯示，也可存儲(chǔ)到SD卡，供后期海量數(shù)據(jù)的分析、比對(duì)使用。

2.1 系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)及機(jī)械結(jié)構(gòu)

金標(biāo)免疫試紙條上顯色物質(zhì)為納米金顆粒，其聚集形成暗紅色條帶，對(duì)綠光的吸收最強(qiáng)烈。為了增加光強(qiáng)，本系統(tǒng)中對(duì)稱(chēng)安裝一對(duì)高穩(wěn)定性的強(qiáng)光綠色LED作為照明光源，其波長(zhǎng)約為520 nm，接收部分使用高靈敏度的光電二極管。光路模塊結(jié)構(gòu)如圖2所示，掃描系統(tǒng)機(jī)械圖如圖3所示。

從圖2和圖3可以看出，LED光源和光電二極管組成光路系統(tǒng)。光路系統(tǒng)固定在封閉暗箱內(nèi)，并可以隨步進(jìn)電機(jī)沿著導(dǎo)軌滑動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)試紙條檢測(cè)區(qū)域的掃描。掃描一次的步程為11.5 mm，時(shí)間為8 s。

2.2 系統(tǒng)電路設(shè)計(jì)

電路設(shè)計(jì)是本系統(tǒng)設(shè)計(jì)的重點(diǎn)。對(duì)試紙條的掃描檢測(cè)不可能在完全封閉、不透光的環(huán)境中進(jìn)行，因此，光電傳感器接收的反射光信號(hào)中必然混雜著環(huán)境光線(xiàn)等一系列噪聲信號(hào)的干擾。如何從強(qiáng)干擾噪聲中提取出有效反射光信號(hào)是本次設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵技術(shù)。

干擾噪聲和有效反射光信號(hào)在測(cè)量中一直混雜著，很難從時(shí)域上區(qū)分，故考慮從頻域上去噪。干擾噪聲處于低頻段，而系統(tǒng)需要采集的反射光信號(hào)是與光源一致(即可調(diào))的。所以可將綠光LED光源調(diào)制到中頻段，即可產(chǎn)生中頻段的反射光信號(hào)，再通過(guò)濾波、解調(diào)即可得到去除噪聲的有效光電信號(hào)[6]。

如圖4所示，使用交流調(diào)制驅(qū)動(dòng) LED，使 LED發(fā)出的綠光處于2 kHz的中頻波段。試紙條反射的光信號(hào)通過(guò)光電二極管接收后轉(zhuǎn)為電流信號(hào)，電流信號(hào)通過(guò)精密I/V轉(zhuǎn)換電路后變成電壓信號(hào)。此電壓信號(hào)經(jīng)過(guò)帶通濾波后，實(shí)現(xiàn)與干擾噪聲的分離，然后進(jìn)行放大，得到交流待檢信號(hào)Signal_AC。Signal_AC的幅值表征反射光的光強(qiáng)，但此信號(hào)無(wú)法直接送入A/D轉(zhuǎn)換器得到幅值，還需要恰當(dāng)?shù)臋z波電路實(shí)現(xiàn)信號(hào)解調(diào)，經(jīng)過(guò)檢波電路后的信號(hào)如圖4中Signal_AD。系統(tǒng)采用的A/D轉(zhuǎn)換器具有數(shù)字低通濾波器的功能，相當(dāng)于將信號(hào)積分平均處理。如此，Signal_AD最終轉(zhuǎn)化成直流信號(hào)，再進(jìn)行采樣送入單片機(jī)處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

實(shí)驗(yàn)樣品如圖5所示，每張?jiān)嚰垪l中有兩條紅線(xiàn)，其中上面一條顏色較深，為C線(xiàn)，起對(duì)照作用；下面一條顏色較淺的為T(mén)線(xiàn)，T線(xiàn)顏色深淺即表征樣品的濃度大小。配置T/C深淺比值分別為 100%、50%、30%、10%、5%的5個(gè)試紙條進(jìn)行掃描測(cè)試。

掃描檢測(cè)的結(jié)果如圖6所示。每條試紙條掃描后的波形有兩個(gè)波谷，表征兩條色帶對(duì)光源的兩個(gè)吸收峰。為了準(zhǔn)確獲取曲線(xiàn)上的T值、C值，采用面積積分法，即分別求取兩個(gè)波谷面積T_Area、C_Area，然后求取波谷相對(duì)面積比T/C。從圖中可以看出，5份樣品中對(duì)照線(xiàn)、檢測(cè)線(xiàn)均被檢出，檢測(cè)結(jié)果分別為 100%、49.2%、29.6%、10.6%、4.5%。每份樣品檢出值與實(shí)際值誤差均小于1%。對(duì)2號(hào)、5號(hào)樣品分別掃描檢測(cè)10次，結(jié)果如圖7所示。2號(hào)樣品均值為4.49%，變異系數(shù)為1.15%；5號(hào)樣品均值為49.5%，變異系數(shù)為0.5%。可見(jiàn)，該系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性很高，變異系數(shù)小于2%。

基于光電檢測(cè)技術(shù)成功研制了一套金標(biāo)免疫試條分析儀。系統(tǒng)通過(guò)對(duì)光源信號(hào)的調(diào)制及對(duì)接收信號(hào)的解調(diào)技術(shù)，成功去除了干擾噪聲，提高了儀器檢測(cè)精度。使用標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)試紙條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際值非常接近，誤差小于1%；樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)均低于2%，表明該儀器測(cè)量結(jié)果穩(wěn)定性高，抗干擾能力強(qiáng)。本儀器在金標(biāo)試紙條的快速、定量檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。

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