異丙腎上腺素誘導(dǎo)慢性心力衰竭大鼠模型的建立＊

羅時(shí)珂，李 萍，程曉曙

（南昌大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科 330006）

心血管疾病在我國(guó)發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅著人們的健康，而慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管疾病的共同轉(zhuǎn)歸，是心臟病的攻堅(jiān)戰(zhàn)場(chǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是臨床研究的基礎(chǔ)，建立穩(wěn)定的動(dòng)物心衰模型是研究心衰的發(fā)病機(jī)制、病理改變及新的治療策略的重要前提。目前存在多種方案構(gòu)建大鼠CHF模型，比如縮窄腹主動(dòng)脈法、結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法、藥物誘導(dǎo)以及快速起搏等［1］，其中的藥物誘導(dǎo)主要以皮下注射異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）為主，大鼠注射異丙腎上腺素后心肌出現(xiàn)彌漫性壞死和纖維化，心肌細(xì)胞收縮幅度及速度均降低，出現(xiàn)CHF表現(xiàn)。但是目前制作CHF模型所用的ISO有效劑量仍有多種報(bào)道，且不同劑量下的動(dòng)物存活率也需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射不同劑量的ISO來(lái)制備大鼠CHF模型，觀察有效的ISO劑量，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Sprague－Dawley大鼠70只（體質(zhì)量180～210g），江西省中醫(yī)學(xué)院提供［動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（贛）2005－0001］，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組（n＝10）、小劑量ISO損傷組（n＝20）、中劑量ISO損傷組（n＝20）、大劑量ISO損傷組（n＝20）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 小劑量組皮下緩慢注射ISO 2.0mg／kg，每日1次，連續(xù)4周；中劑量組:皮下緩慢注射ISO 2.5mg／kg，每日1次，連續(xù)4周；大劑量組:皮下緩慢注射ISO 3.0mg／kg，每日1次，連續(xù)4周；對(duì)照組:同樣方法注射2.0mg／kg生理鹽水。

表1 4周末對(duì)照組與用藥前大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較（）

表1 4周末對(duì)照組與用藥前大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較（）

＊:P＞0.05，與對(duì)照組比較。

組別 n LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）對(duì)照組 10 4.46±0.23 2.43±0.30 81.87±4.28 49.12±4.21用藥前組 70 4.52±0.48＊ 2.45±0.29＊ 83.20±6.40＊ 47.80±3.05＊

表2 4周末各組大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較（）

表2 4周末各組大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較（）

＊:P＜0.01，與對(duì)照組比較；▲:P＜0.01，☆:P＜0.05，與小劑量組比較；■:P＜0.01，與中劑量組比較。

組別 n LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（mm） LVFS（mm）對(duì)照組 10 4.62±0.38 2.62±0.07 81.00±3.87 48.00±3.16小劑量ISO組 20 5.74±0.15＊ 3.92±0.14＊ 71.20±2.58＊ 36.20±3.03＊中劑量ISO組 18 6.37±0.29＊▲ 4.67±0.15＊▲ 56.40±3.84＊▲ 30.60±2.41＊☆大劑量ISO組 6 7.96±0.23＊▲■ 5.28±0.26＊▲■ 46.00±3.16＊▲■ 23.40±2.42＊▲■

1.2.2 心臟超聲檢查評(píng)價(jià)心功能 4周末4組大鼠以0.3%戊巴比妥鈉溶液（10.0mL／kg）腹腔注射麻醉后備皮，應(yīng)用超聲心動(dòng)儀（西門子ACUSON Sequoia512）及5～12MHz高頻線控探頭（西門子公司）進(jìn)行超聲檢測(cè)，檢測(cè)左室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（left ventricualr end－systolic dimension，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventrieular ejection fraction，LVEF）、左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventrieular shortening fractionl，LVFS）。

1.2.3 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)測(cè)定 用預(yù)冷的生理鹽水洗去心臟殘留血液，剪去周圍結(jié)締組織和血管，濾紙吸干水分稱量心臟濕質(zhì)量。心臟質(zhì)量指數(shù)＝心臟濕質(zhì)量／體質(zhì)量。

1.2.4 大鼠血清B型鈉尿肽（BNP）測(cè)定 從各組每只大鼠眼球取血4mL，4℃，3000r／min，離心10min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定BNP含量，均嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般性狀比較 與對(duì)照組大鼠相比，不同劑量ISO組大鼠普遍出現(xiàn)毛色暗黃，納食減少，體質(zhì)量增加緩慢，出現(xiàn)呼吸伴有氣喘、活動(dòng)減少等心衰表現(xiàn)。

2.2 各組大鼠存活率比較 大劑量ISO組大鼠4周后死亡14只，存活率30%；中劑量ISO組大鼠4周后死亡2只，存活率90%；小劑量ISO組大鼠及對(duì)照組大鼠未見(jiàn)死亡，存活率均為100%。

2.3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及心功能比較 4周末對(duì)照組大鼠（n＝10）與用藥前大鼠（n＝70）LVEDD、LVESD、LVEF、FS等結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

大、中、小劑量ISO組大鼠心臟LVEDD、LVESD較對(duì)照組有所增大，LVEF、FS較對(duì)照組有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)比較 大、中、小劑量ISO組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)較對(duì)照組增大，其中大劑量ISO組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)大于中、小劑量ISO組，中劑量ISO組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)大于小劑量ISO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.5 各組大鼠血清BNP比較 大、中、小劑量ISO組大鼠血清BNP較對(duì)照組增大，其中大劑量ISO組大鼠血清BNP大于中、小劑量ISO組，中劑量ISO組大鼠血清BNP大于小劑量ISO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 4周末各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、血清BNP比較（）

表3 4周末各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、血清BNP比較（）

＊:P＜0.01，與對(duì)照組比較；▲:P＜0.01，與小劑量ISO 組比較；☆:P＜0.01，與中劑量ISO組比較。

組別 n 心臟質(zhì)量指數(shù)（mg／g） 血清BNP（ng／mL）對(duì)照組10 2.13±0.25 0.39±0.03小劑量ISO組 20 3.16±0.12＊ 3.50±0.32中劑量ISO組 18 3.58±0.08＊▲ 4.86±0.12大劑量ISO組 6 3.96±0.11＊▲☆5.54±0.29

3 討 論

建立確切的動(dòng)物模型是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，目前建立動(dòng)物CHF模型的方法主要有縮窄腹主動(dòng)脈法、結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法、藥物誘導(dǎo)及快速起搏法等，其中ISO誘導(dǎo)具有無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需呼吸機(jī)支持、可重復(fù)性高、僅需保溫等特點(diǎn)［2］。本實(shí)驗(yàn)制作動(dòng)物模型的具體機(jī)制主要是通過(guò)皮下注射ISO后，加快大鼠心率，心肌收縮力持續(xù)增強(qiáng)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死、纖維化，導(dǎo)致心室重構(gòu)，最終引發(fā)心力衰竭［3－6］。應(yīng)用兒茶酚胺類藥物能使心肌出現(xiàn)多發(fā)性灶性壞死造成心肌彌散性壞死和纖維化［7－9］。目前關(guān)于ISO建立CHF模型存在多種報(bào)道，既有注射方式的不同，如大鼠皮下注射及腹腔注射，又有注射劑量上的差異，還存在ISO注射天數(shù)上的長(zhǎng)短等［10－13］，CHF模型的成功建立不僅要求ISO注射劑量的合理，同時(shí)需要密切觀察CHF發(fā)生所需的合理時(shí)間，從而保證動(dòng)物模型較高的存活率。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步明確ISO的有效劑量，采用皮下注射的方式，在CHF模型制備的過(guò)程中密切觀察大鼠的性狀、行為、體征的改變，對(duì)比不同ISO劑量下各組大鼠的心功能的改變及存活率。4周末，對(duì)照組無(wú)大鼠死亡，大、中、小劑量ISO組大鼠的存活率分別為30%、90%及100%，大劑量ISO組的大鼠存活率明顯低于后兩組，小劑量ISO組的大鼠存活率最高，但是對(duì)比中、小劑量ISO組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)、心功能改變及心臟指數(shù)、血清BNP值的變化，可以發(fā)現(xiàn)中劑量ISO組大鼠LVEDD、LVESD均較小劑量ISO組明顯增大，較小劑量ISO組LVEF、LVFS則明顯下降，心臟質(zhì)量指數(shù)及BNP中劑量ISO組較小劑量ISO組明顯增高，因此綜合大鼠存活率及心功能等相關(guān)指標(biāo)，ISO皮下注射劑量為2.5mg·kg－1·d－1是誘導(dǎo)大鼠CHF模型最為合適的劑量，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)密切觀察了建立CHF動(dòng)物模型適宜的時(shí)間，主要以大鼠的一般性狀的改變、相應(yīng)的心臟彩超變化及血清BNP改變作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，得出大鼠ISO皮下注射4周是較為適宜的時(shí)間。

建模過(guò)程中還需注意下列問(wèn)題來(lái)減少大鼠的意外死亡，提高存活率:（1）造模過(guò)程中，掌握熟練抓取大鼠，減少注射、灌胃、行心臟彩超等過(guò)程中大鼠出現(xiàn)驚嚇、掙扎等應(yīng)激反應(yīng)，減少大鼠的意外死亡；（2）大鼠腹部皮下注射藥物過(guò)程中，需避免進(jìn)針過(guò)深而損傷肝、脾等器官，引起大鼠死亡；（3）大鼠在行心臟超聲、抽血測(cè)BNP等檢查時(shí)，需先行麻醉，麻醉藥的劑量很重要，需根據(jù)體質(zhì)量來(lái)計(jì)算，麻醉過(guò)深易致大鼠死亡，過(guò)淺則達(dá)不到麻醉效果，影響操作；（4）每日關(guān)注大鼠皮下注射部位有無(wú)潰瘍，若出現(xiàn)潰瘍則及時(shí)用碘伏局部消毒，預(yù)防感染。心功能的檢測(cè)對(duì)于評(píng)估大鼠心衰模型成功的建立具有重要意義，超聲心動(dòng)圖因具有操作簡(jiǎn)便、便于動(dòng)態(tài)觀察、對(duì)動(dòng)物模型損傷小等優(yōu)勢(shì)成為心功能的檢測(cè)的首選手段［14］，此外本實(shí)驗(yàn)還采用了檢測(cè)大鼠血清BNP來(lái)評(píng)估心功能。研究表明，BNP是一種心血管肽類激素，是心、腦器官的重要內(nèi)分泌因子，參與了CHF發(fā)生、發(fā)展的病理過(guò)程，可精確反映心力衰竭程度的重要指標(biāo)，是評(píng)估大鼠CHF模型的重要手段［15］。應(yīng)用ISO皮下注射制備動(dòng)物CHF模型具有操作簡(jiǎn)便、方法簡(jiǎn)單、模型確切的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用合理的用藥劑量及用藥時(shí)間，不斷積累經(jīng)驗(yàn)，可降低大鼠的死亡率，提高實(shí)驗(yàn)成功率。超聲心動(dòng)圖及BNP是測(cè)定大鼠心功能的重要手段，并且可動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)于成功建立CHF模型具有重要意義。

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