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    特異性激活SHH通路對(duì)急性腦缺血大鼠血管再生影響

    2012-08-11 08:26:04朱美霖白宏英曾志磊張沛琳
    關(guān)鍵詞:信號(hào)

    朱美霖, 白宏英, 曾志磊, 張沛琳

    腦缺血后血管再生正在受到越來越多的關(guān)注,研究表明腦缺血后血管再生能夠盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血供,挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元[1,2]。腦缺血后,缺血組織釋放細(xì)胞因子動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞,使其歸巢并通過自身的分化、增殖形成新生血管。新生血管可以為組織細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧,進(jìn)而改善局部血供,縮小梗死灶[3],有助于腦缺血患者缺損的神經(jīng)功能恢復(fù)。Sonic hedgehog信號(hào)通路(SHH)與血管再生有著密切的聯(lián)系,Kusano[4]等發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變中加入外源性SHH可以誘導(dǎo)神經(jīng)血管生成。SHH信號(hào)通路可影響眾多血管新生因子,如VEGF和CD105等,從而調(diào)控血管生成。VEGF是血管生成的主要調(diào)控因子,CD105是血管再生所必需的,其表達(dá)與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)。既往對(duì)SHH信號(hào)通路對(duì)腦缺血后血管再生的研究甚少,本實(shí)驗(yàn)擬用purmorphamine激活SHH信號(hào)通路,以探究SHH信號(hào)通路激活對(duì)腦缺血后血管再生因子的影響,為腦缺血治療提供新的方向。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物分組及給藥方法 健康成年雄性SD大鼠108只,清潔級(jí),體重280~350g(由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),給予標(biāo)準(zhǔn)的飼料,自由進(jìn)食進(jìn)水。SD大鼠隨機(jī)分為3組,即A組:假手術(shù)組(n=12);B組:模型組(n=48);C組:給藥組(n=48)。其中B組和C組按時(shí)間分為4個(gè)亞組即6h、12h、24h、48h,每亞組12 只。C 組于術(shù)后按0.69/mg給予purmorphamine溶液腹腔注射,A組和B組于術(shù)后給予等劑量的DMF溶液注射。

    1.2 藥品與試劑 purmorphamine粉劑(T.R.C,CAS:483367-10-8)購自上海凱試公司。使用前先用DMF溶解,再用PBS溶液稀釋。VEGF兔抗鼠多克隆抗體、CD105兔抗鼠多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ。SP9000試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物工程公司。PCR試劑盒、內(nèi)參β-actin、DEPC水、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.3 缺血模型的制備 參照Zea longa[5]等報(bào)道的線栓法制作SD大鼠永久性大腦中動(dòng)脈缺血模型。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈及其分支,并不插入線栓和結(jié)扎。術(shù)中大鼠體溫保持37℃。于大鼠清醒1h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Zea longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。0分,無任何神經(jīng)缺損癥狀;1分,不能完全伸直對(duì)側(cè)前爪;2分,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向?qū)?cè)傾倒;4分,不能自由行走;5分,死亡。其中評(píng)分1~4分入選后續(xù)試驗(yàn),如在實(shí)驗(yàn)過程中有死亡或者不符合要求的大鼠,取同批次大鼠補(bǔ)足數(shù)量。

    1.4 標(biāo)本制備 10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛心臟灌洗固定24h備用。石蠟包埋后連續(xù)切片,制備成4μm厚度切片。

    1.5 免疫組化測(cè)定缺血半暗帶區(qū)域VEGF和CD105的表達(dá) 采用SP法,按照說明書操作。每張切片隨機(jī)選取10×40視野5個(gè),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。

    1.6 RT-PCR檢測(cè)缺血半暗帶內(nèi)PTCH-1 mRNA的表達(dá)情況 10%水合氯醛麻醉大鼠,斷頭取腦,液氮冷凍后放置-80℃冰箱保存。按試劑盒說明書提取出腦組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增上游引物為5’-AAATGCTGAATAAAGCCGAAGT-3’,下游引物為 5’-GTGCCACCCACAATCAACTC-3’,擴(kuò)增條件如下:94℃預(yù)變性2min,1 個(gè)循環(huán);94℃變性 30s,58℃退火 30s,72℃延伸2min,共計(jì)35個(gè)循環(huán);72℃延伸6min。實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為內(nèi)參。PTCH長度為199bp,擴(kuò)增后得到所需目的基因經(jīng)過電泳鑒定后采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,目的基因PTCH-1的表達(dá)量與β-actin的DNA條帶灰度比值進(jìn)行計(jì)算。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 PTCH-1 mRNA表達(dá)情況 與A組比較,B組和C組PTCH-1 mRNA表達(dá)增高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。B組和C組缺血半暗帶區(qū)域的PTCH-1 mRNA表達(dá)于腦缺血6h后開始升高,24h達(dá)高峰,之后有所下降但仍維持在較高水平。但與C組各時(shí)間點(diǎn)PTCH-1 mRNA與B組相比較表達(dá)顯著增高,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

    2.2 VEGF表達(dá)情況 A組中大鼠腦組織中VEGF存在少量陽性細(xì)胞表達(dá),B組和C組6h表達(dá)量開始增加,于48h表達(dá)最為顯著。陽性表達(dá)區(qū)域主要存在于皮層下區(qū)和海馬區(qū)的梗死灶周圍。C組與A組、B組相比較各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2、圖1)。

    2.3 CD105測(cè)定結(jié)果 A組CD105弱表達(dá),B組于腦缺血后6h表達(dá)開始增高,且隨著時(shí)間增加表達(dá)逐漸增高,C組與B組各時(shí)間點(diǎn)相比較CD105表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

    表1 大鼠腦組織中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PTCH-1mRNA表達(dá)(n=6,)

    表1 大鼠腦組織中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PTCH-1mRNA表達(dá)(n=6,)

    與A組相比*P<0.05;與B組相比△P<0.05

    組別/時(shí)間點(diǎn)6h 12h 24h 48h A組B組C組0.085 ±0.006 0.102 ±0.007*0.116 ±0.009*△0.097 ±0.008 0.376 ±0.019*0.549 ±0.032*△0.093 ±0.007 0.537 ±0.024*0.7411 ±0.444*△0.0927 ±0.005 0.409 ±0.0140*0.550 ±0.020*△

    表2 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)(平均光密度)(n=6,)

    表2 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)(平均光密度)(n=6,)

    與A組相比*P<0.05;與B組相比△P<0.05

    組別/時(shí)間點(diǎn)6h 12h 24h 48h A組B組C組99.36 ±3.29 107.04 ±4.59*116.69 ±7.14*△99.37 ±3.29 130.71 ±6.72*132.73 ±10.55*△105.27 ±5.18 136.20 ±10.00*148.04 ±13.17*△99.37 ±3.29 145.47 ±7.85*159.24 ±9.91*△

    表3 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)CD105表達(dá)(平均光密度)(n=6,)

    表3 大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)CD105表達(dá)(平均光密度)(n=6,)

    與A組相比*P<0.05;與B組相比△P<0.05

    組別/時(shí)間點(diǎn)6h 12h 24h 48h A組B組C組58.94 ±3.02 87.03 ±6.012*118.24 ±6.85*△58.94 ±3.02 114.03 ±7.36*143.93 ±7.18*△66.95 ±2.84 121.60 ±7.23*163.85 ±5.08*△68.58 ±2.78 137.49 ±6.53*162.25 ±4.4*△

    3 討論

    腦缺血后,缺血區(qū)血管再生范圍和程度影響了缺血區(qū)的血流灌注,增加缺血區(qū)血供或者促進(jìn)血管再生可加快腦缺血后損傷腦組織的修復(fù)。近些年研究發(fā)現(xiàn)SHH信號(hào)通路與血管再生有著密切關(guān)系。Kusano等[6]研究發(fā)現(xiàn)SHH通路可以誘導(dǎo)局部缺血組織血管再生,且SHH誘導(dǎo)血管新生的能力強(qiáng)于VEGF。Pola R等[7]在研究SHH通路時(shí)指出SHH通路可以通過上調(diào)VEGF和ANG誘導(dǎo)形成較大直徑的血管。SHH信號(hào)通路誘導(dǎo)血管再生可能是通過SHH/GLI/SMO通路實(shí)現(xiàn)的,SHH信號(hào)通路通過PTCH和SMO兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)SHH信號(hào)通路處于靜止期時(shí),PTCH與SMO結(jié)合抑制SMO活性。當(dāng)SHH通路被激活時(shí),SHH蛋白與PTCH結(jié)合,PTC/SMO復(fù)合物釋放SMO活性,SMO激活下游GLI從而誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。SHH不足時(shí),PTCH-1表達(dá)降低,SHH通路激活時(shí),PTCH-1表達(dá)增加。因此PTCH-1常作為檢測(cè)SHH信號(hào)通路活化的標(biāo)志分子[8]。本課題通過PCR測(cè)定PTCH-1反映SHH信號(hào)是否處于激活狀態(tài)。

    purmorphamine是一種小分子嘌呤衍生物,分子量為520.62,可透過血腦屏障。purmorphamine與SMO結(jié)合后SMO蛋白空間構(gòu)象發(fā)生改變從而激活SHH通路下游分子。本研究發(fā)現(xiàn)PTCH-1在腦缺血后6h表達(dá)有所增加,提示腦缺血后存在內(nèi)源性的SHH信號(hào)通路激活,這與既往研究結(jié)果一致。加入purmorphamine溶液后,PTCH-1表達(dá)明顯增加,24h升高最為顯著,48h有所降低,與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示給予外源性SHH信號(hào)通路激活劑purmorphamine可以有效激活SHH信號(hào)通路,但具有時(shí)效性,隨著時(shí)間推移,這種效應(yīng)逐漸減弱,難以持續(xù)激活SHH信號(hào)通路。

    VEGF是血管生長的重要調(diào)節(jié)物質(zhì),在內(nèi)皮細(xì)胞分化和神經(jīng)形成過程中參與早期血管生成,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活和增殖,加速形成新生血管。CD105(endoglin)通過對(duì)TGF-β調(diào)控影響血管再生,也是血管再生中必需的因子。CD105在正常組織幾乎不表達(dá),但是在新生血管強(qiáng)表達(dá),可以作為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)志物。有研究表明CD105測(cè)定的血管密度是一個(gè)獨(dú)立的指標(biāo),能定量區(qū)別新生血管和已存在的血管[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦缺血后6h促血管再生因子VEGF和新生血管標(biāo)志物CD105表達(dá)開始增多,于48h升高最為顯著,提示腦缺血可刺激體內(nèi)的內(nèi)源性VEGF和CD105表達(dá),應(yīng)用purmorphamine后,VEGF和CD105的表達(dá)均明顯增加,提示激活SHH通路后可上調(diào)VEGF和CD105表達(dá),促進(jìn)血管再生。另外,應(yīng)用purmorphamine后,PTCH-1的表達(dá)高峰在24h,而VEGF和CD105表達(dá)高峰有一定延遲,提示SHH信號(hào)通路激活促進(jìn)血管再生的效應(yīng)不是即刻的,這可能與SHH信號(hào)通路下游分子較多有關(guān),也可能與相關(guān)蛋白的分泌表達(dá)時(shí)間有關(guān)。

    可否連續(xù)應(yīng)用外源性激活劑purmorphamine激活SHH通路而形成對(duì)血管再生的持續(xù)效應(yīng)有待于進(jìn)一步研究。

    圖1 免疫組化測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)情況(A:假手術(shù)組;B:模型組;C:給藥組)

    [1]Rosell-novel A,Montaner J,Alvarez-Sabin J.Angiogenesis in human cerebral ischemia[J].Rev Neurol,2004,38(11):1076-1082.

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    [7]Pola R,Ling LE,Siliver M,et al.The morphogen Sonic hedgehog is an indirect angiogenic agent upregulating two families of angiogenic growth factors[J].Nat Med,2001,7(6):706-711.

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