海刺猬體腔液凝集素的純化、性質(zhì)及其色氨酸的化學(xué)修飾

李丹彤吳振海李悅王樹敏朱瑩

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

海刺猬體腔液凝集素的純化、性質(zhì)及其色氨酸的化學(xué)修飾

李丹彤,吳振海,李悅,王樹敏,朱瑩

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

通過DEAE-纖維素52離子交換層析、Sephadex G-200凝膠層析,從海刺猬體腔液中分離純化海刺猬Glyptocidariscrenularis凝集素 (簡稱為GCL),并對其部分性質(zhì)和色氨酸的化學(xué)修飾進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:在還原與非還原SDS-PAGE上,GCL都顯示單一蛋白質(zhì)條帶,其相對分子量為94 462;GCL對人O型、兔、雞、狗紅細(xì)胞均具有血凝活性,對兔和狗紅細(xì)胞的血凝活性最強(qiáng),但對人A、B、AB型及鯽紅細(xì)胞無血凝活性;GCL血凝活性在溫度為4～33℃時最高,經(jīng)36℃熱處理10 min后,GCL對兔紅細(xì)胞的血凝活性保留25%,經(jīng)48℃加熱10min后,其血凝活性完全喪失;GCL血凝活性在pH為7.5～8.5時最高; Ca2+對GCL血凝活性無抑制作用,EDTA和Mg2+對其血凝活性有抑制作用;GCL血凝活性不被所測試的α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和γ-球蛋白所抑制,但被蔗糖和麥芽糖所抑制,最小抑制濃度分別為40 mmol/L和20 mmol/L;用N-溴代丁二酰亞胺 (NBS)對GCL分子中的色氨酸 (Trp)殘基進(jìn)行化學(xué)修飾,有5.1個Trp殘基被修飾,修飾后其血凝活性喪失75%,表明Trp殘基是GCL血凝活性的重要組成部分。

海刺猬;凝集素;純化;化學(xué)修飾

凝集素是一類具有糖專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白。凝集素具有凝集細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,激活淋巴細(xì)胞,抑制血小板凝集,抗菌、抗病毒等多種生物活性?；瘜W(xué)修飾是研究凝集素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ),目前已有對川木通[1]、大黑花蕓豆[2]、黃精[3]等凝集素分子進(jìn)行化學(xué)修飾的研究[1-3],以探討凝集素的作用機(jī)理。

海刺猬Glyptocidariscrenularis屬于無脊椎動物棘皮動物門、海膽綱、正形目、疣海膽科,是疣海膽科現(xiàn)今僅存的唯一代表種。目前,國內(nèi)外已有一些關(guān)于海膽凝集素的研究報道。Giga等[4]、Nakagawa等[5-6]進(jìn)行了紫海膽Anthocidariscrassispinat體腔液及Toxopneustidpileolus球形叉棘凝集素的分離純化及其性質(zhì)的研究;Ozeki等[7]進(jìn)行了紫海膽卵凝集素氨基酸序列及其性質(zhì)的研究;Shamshurina等[8]在光棘球海膽Strongylocentrotusnudus的體腔液中,發(fā)現(xiàn)了2種免疫化學(xué)相同的甘露糖結(jié)合凝集素;Takei等[9]從Toxopneustidpileolus球形叉棘中,分離得到一種海膽凝集素 (sea urchin lectin-1, SUL-1),發(fā)現(xiàn)SUL-1可以誘導(dǎo)DC分化成熟和Th1細(xì)胞極化,并可應(yīng)用于癌癥免疫治療的DC疫苗中。目前,關(guān)于海刺猬凝集素的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究中,作者從海刺猬體腔液中分離純化海刺猬凝集素 (簡稱為GCL),并對其部分性質(zhì)和色氨酸的化學(xué)修飾進(jìn)行研究,旨在為研究海刺猬凝集素的作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海刺猬購于大連市榮盛水產(chǎn)品批發(fā)市場,兔子購于大連醫(yī)科大學(xué)遼寧省實(shí)驗(yàn)動物中心,雞、鯽由市場購買,狗血由某寵物醫(yī)院提供,人全血由大連市紅十字血液中心提供。

試驗(yàn)試劑有:Sephadex-G 200(Phannacia進(jìn)口分裝)、藍(lán)色葡聚糖 (Blue Dextran 2000)(上海泊奧生物科技有限公司)、細(xì)胞色素C(相對分子量為11 700)(Sigma)、木瓜蛋白酶 (相對分子量為21 000)(上海佳和生物科技有限公司)、牛血清白蛋白 (相對分子量為66 200)(上海浦江生物化學(xué)研究所)、γ-球蛋白 (相對分子量為165 000) (human,Serva)、DEAE-纖維素52(Whatman進(jìn)口分裝)、N-溴代丁二酰亞胺 (NBS)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),其它試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 凝集素的分離純化

1)粗提液的制備 海刺猬購回后用過濾海水沖洗干凈,再用注射器從其緣口膜抽取體腔液,經(jīng)離心 (6 000 r/min,4℃,30 min),去除沉淀,取上清液,在TB(0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.5)緩沖液中透析48 h(4℃),中間更換兩次透析液,即得凝集素粗提液。

取上清液,在 TBS(0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.5)緩沖液中反透析48 h (4℃),中間更換兩次透析液,測定其血凝活性。

2)DEAE-纖維素52離子交換層析

第1次離子交換層析。先用TB緩沖液平衡層析柱至A280nm＜0.01,再將凝集素粗提液上層析柱(1.6 cm×30 cm)進(jìn)行分步洗脫,即先用洗脫液Ⅰ(含0.2 mol/L NaCl的TB緩沖液)進(jìn)行洗脫,從第14管開始再用洗脫液Ⅱ (含0.5 mol/L NaCl的TB緩沖液)進(jìn)行洗脫,流速為30 mL/h,每管5 mL,在280 nm下測定吸光值 (A280nm)。用蒸餾水對各蛋白質(zhì)吸收峰進(jìn)行充分透析,然后在TBS緩沖液中反透析,用兔紅細(xì)胞測定其血凝活性,收集有血凝活性的組分。

第2次離子交換層析。樣品為第1次離子交換層析后收集到的具有血凝活性的組分。將洗脫液Ⅰ(含0.2 mol/L NaCl的TB緩沖液)裝入梯度混合器的混合瓶中,再將洗脫液Ⅱ (含0.5 mol/L NaCl的TB緩沖液)裝入儲藏瓶中,開始進(jìn)行梯度洗脫。其余方法與步驟同第1次離子交換層析,測定A280nm,收集具有血凝活性的組分。

3)Sephadex G-200凝膠層析[10]將Sephadex G-200處理后裝層析柱 (1.6 cm×90 cm),樣品為第2次離子交換層析后收集到的具有血凝活性的組分,層析用洗脫液為含0.2 g/L疊氮化鈉 (NaN3)和9 g/L NaCl的 PBS(0.015 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4,pH 7.2)緩沖液,流速為18 mL/h,每管3 mL。用兔紅細(xì)胞檢測其血凝活性,并測定A280nm。收集具有血凝活性的組分,經(jīng)透析、冷凍干燥,得到GCL純化樣品。

1.2.2 凝集素的性質(zhì)

1)蛋白質(zhì)含量的測定[11]采用紫外分光度法測定蛋白含量,以牛血清白蛋白作為對照。

2)血凝活性的測定[12]在96孔V型血凝板上,用40μL GCL與等量生理鹽水系列倍比稀釋后,加入體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸浮液40μL,振勻,靜置2 h,肉眼觀察,無凝集現(xiàn)象時紅細(xì)胞呈大紅點(diǎn)狀并沉積在V型孔底部,有凝集現(xiàn)象時紅細(xì)胞呈網(wǎng)狀不下沉,血凝活力以產(chǎn)生凝集現(xiàn)象時的最小凝集素量或凝集素最大稀釋倍數(shù)的對數(shù)值(log2) 表示。

3)分子量的測定[13]采用SDS-PAGE電泳方法測定分子量。濃縮膠濃度為50 g/L,分離膠濃度為150 g/L,以細(xì)胞色素C、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白和γ-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

4)熱穩(wěn)定性的測定 將凝集素粗提液分成若干份,每份取0.2 mL,分別在4～60℃的溫度梯度下溫育,每一溫度下分別保溫5 min和10 min后取樣,冷卻,測定其血凝活性。

5)pH對GCL血凝活性的影響 參照Ahmed等[14]的方法,配制pH為4.0～10.5的系列緩沖液,測定不同pH緩沖液條件下GCL的血凝活性。pH為4.0～6.0時,采用0.015 mol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液;pH為6.5～7.5時,采用0.015 mol/L磷酸鹽緩沖液;pH為8.0～9.0時,采用0.015 mol/L Tris-HCl緩沖液;pH為9.5～10.5時,采用0.015 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液。在96孔V型血凝板上,先在每孔加入40μL pH緩沖液,再往第一孔中加入40μL GCL溶液,混勻后進(jìn)行倍比稀釋,然后加入40μL體積分?jǐn)?shù)為2%的兔紅細(xì)胞懸浮液,振勻,靜置2 h,觀察不同pH緩沖溶液對GCL血凝活性的影響。

6)EDTA及二價金屬離子對GCL血凝活性的影響[15]在96孔V型血凝板中,分別加入40μL 100 mmol/L的EDTA、CaCl2、MgCl2溶液,用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋,然后加入40μL能凝集兔紅細(xì)胞的最小濃度2倍的GCL,靜置15 min(室溫)后,再加入40μL體積分?jǐn)?shù)為2%的兔紅細(xì)胞懸浮液,振勻,靜置2 h,觀察EDTA及二價金屬離子對GCL血凝活性的影響。

7)血凝抑制的測試 選擇糖類:α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、麥芽糖、D -葡萄糖,起始濃度為80 mmol/L,選擇糖蛋白:γ -球蛋白,起始濃度為20 mg/mL。在96孔V型血凝板中,分別加入40μL各種糖、糖蛋白溶液,用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋,然后加入40μL能凝集兔紅細(xì)胞的最小濃度2倍的GCL,靜置15 min(室溫)后,再加入40μL體積分?jǐn)?shù)為2%的兔紅細(xì)胞懸浮液,振勻,靜置2 h,測定每種糖和糖蛋白對GCL血凝活性的最小抑制濃度。

1.2.3 色氨酸的化學(xué)修飾 參照鮑錦庫等[16]的方法,用pH為4.0的0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液配制GCL溶液,使其濃度為2.56 mg/mL,然后每次加入10μL濃度為10 mmol/L的NBS溶液 (用pH為4.0的0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液配制),間隔5 min測定A280nm,再加入 NBS溶液,直至A280nm不再下降 (或略有升高)為止,透析除去過量的NBS,收集樣品濃縮并測定其活性。定量計算被修飾的色氨酸殘基:

N(Trp)=(1.31×ΔA280nm×Mr×V)/(5500×m),

或

N(Trp)=(1.31×ΔA280nm×Mr)/(5500×ρ),其中:N(Trp)為每個GCL分子中被修飾的色氨酸 (Trp)殘基數(shù);Mr為GCL的分子量;V為反應(yīng)體系的初始體積 (mL);m為GCL的含量 (mg);ρ為被滴定溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度 (mg/mL); 1.31為經(jīng)驗(yàn)系數(shù);5 500為色氨酸的摩爾消光系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GCL的分離純化

海刺猬體腔液經(jīng)離心、透析得到凝集素粗提液;凝集素粗提液經(jīng)第1次DEAE-纖維素52離子交換層析,得到2個蛋白峰和1個活力峰 (圖1);經(jīng)第2次DEAE-纖維素52離子交換層析,得到1個蛋白峰和1個活力峰 (圖2);再經(jīng)Sephadex G-200凝膠層析,得到2個蛋白峰和1個活力峰 (圖3),收集具有血凝活性的組分,經(jīng)透析、冷凍干燥,得到GCL純化樣品,純化步驟及有關(guān)數(shù)據(jù)見表1。

其三，解決民生短板，促進(jìn)發(fā)展成果人人共享。馬克思多次論述了生產(chǎn)資料社會占有的必然性。顯然，使個人在以社會名義直接占有生產(chǎn)資料的基礎(chǔ)上，能夠自覺而主動地駕馭自己的社會關(guān)系，走向?qū)ι鐣敻?、知識、權(quán)力和資源的共享，才能拓展個體發(fā)展的空間和程度。社會發(fā)展的目標(biāo)是“為了一切人和完整人的發(fā)展”[17]。堅(jiān)持共享發(fā)展理念，強(qiáng)調(diào)分配公正，“不是均等的分配，而是關(guān)注分配原則、分配形式的公平性，關(guān)注在社會成員或群體之間進(jìn)行權(quán)利、權(quán)力、義務(wù)和責(zé)任配置的問題”[18]。我們應(yīng)在發(fā)展中不斷消除區(qū)域差距、城鄉(xiāng)差距和收入差距，促進(jìn)社會公平正義，使全體人民都能公平公正地分享與其奮斗實(shí)干相匹配的發(fā)展機(jī)遇和成果。

2.2 GCL的分子量

純化的GCL樣品經(jīng)還原與非還原SDS-PAGE,都顯示單一蛋白質(zhì)染色帶 (圖4),這表明從海刺猬體腔液中分離純化的GCL為電泳純的單一樣品,其相對分子量為94 462(圖5)。與紫海膽體腔液凝集素的相對分子量為300 000,經(jīng)還原、非還原SDS-PAGE測得的亞基相對分子量分別為13 000、26 000[4]以及Toxopneustidpileolus凝集素的相對分子量為32 000[5]有一定的差別。

圖1 GCL第1次DEAE-纖維素52離子交換層析Fig.1 Ion-exchange chromatography of GCL on firsttime DEAE-cellulose 52 column

圖2 GCL第2次DEAE-纖維素52離子交換層析Fig.2 Ion-exchange chrom atography of GCL on second time DEAE-cellulose 52 column

2.3 GCL的血凝活性

GCL對不同來源的紅細(xì)胞的凝集效果不同。GCL對兔和狗紅細(xì)胞的血凝活性最高,其血凝活性的對數(shù)值 (log2)均為8;對雞紅細(xì)胞次之,血凝活性的對數(shù)值 (log2)為4;對人O型血紅細(xì)胞具有較弱的血凝活性,血凝活性的對數(shù)值(log2)為2;但對鯽和人A、B、AB型紅細(xì)胞無血凝活性,主要原因可能是由于GCL對不同紅細(xì)胞表面分子的特異性識別不同。據(jù)報道,兔紅細(xì)胞對大多數(shù)凝集素敏感[17],本試驗(yàn)中兔紅細(xì)胞對 GCL同樣敏感。

表1 海刺猬凝集素的分離純化Tab.1 Purification of the lectin from Glyptocidaris crenularis

圖3 GCL Sephadex G-200分子篩凝膠層析Fig.3 Gel filtration of GCL on Sephadex G-200 column

圖4 GCL的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.4 Electrophoresis of GCL on SDS-PAGE

圖5 GCL在SDS-PAGE上分子量的測定Fig.5 The determ ination of molecular weight in the GCL by SDS-PAGE

表2 GCL的熱穩(wěn)定性Tab.2 Thermal stability of the GCL

2.4 GCL的熱穩(wěn)定性

GCL熱穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著溫度的升高和加熱時間的延長,其血凝活性會逐漸降低。GCL在溫度為4～33℃時,其血凝活性最高,經(jīng)36℃熱處理10 min后,對兔紅細(xì)胞血凝活性保留25%,經(jīng)48℃加熱10 min后,其活性完全喪失 (表2)。因此,GCL對溫度變化較為敏感,推斷蛋白質(zhì)在受熱后空間結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的改變可能導(dǎo)致其血凝活性的下降和喪失。

2.5 pH對GCL血凝活性的影響

不同pH緩沖溶液對GCL血凝活性影響的試驗(yàn)結(jié)果表明:pH為 4.0時,無血凝活性;pH為4.5、5.0、6.0、6.5、7.0時,其血凝活性的對數(shù)值 (log2) 分別為 3、3、5、6、6;pH 為 7.5、8.0、8.5時,其血凝活性的對數(shù)值 (log2)均為8;pH為9.0、9.5、10.5時,其血凝活性的對數(shù)值 (log2)分別為6、3、3。本研究結(jié)果表明,當(dāng)pH≥9.0及pH≤7.0時,GCL血凝活性開始下降,當(dāng)pH為7.5～8.5時,其血凝活性最高。說明在偏堿性環(huán)境中GCL的血凝活性最高,推斷這可能與海刺猬生活在弱堿性的海水環(huán)境有一定關(guān)系。

2.6 EDTA及二價金屬離子對血凝活性的影響

EDTA和MgCl2對GCL血凝活性均具有抑制作用,而CaCl2對GCL血凝活性卻沒有抑制作用 (表3),推測GCL本身是一種Ca2+離子依賴型凝集素, Ca2+被EDTA螯合,血凝活性就明顯降低,這與Ca2+對于紫海膽凝集素的血凝活性起著非常重要的作用[7]相一致。

表3 EDTA、二價金屬離子對GCL血凝活性的抑制作用Tab.3 Inhibition of the GCL hemagglutinating activity by EDTA and metal ions

2.7 糖及糖蛋白對GCL血凝活性的影響

糖和糖蛋白對凝集素血凝活性的抑制中,由于它們能與凝集素分子結(jié)合,阻止其與細(xì)胞表面糖分子的結(jié)合,從而抑制凝集素的血凝活性。因此,通過糖抑制試驗(yàn)可知某種凝集素能與哪些或哪類糖專一性結(jié)合,這是凝集素的重要特征之一,同時也可作為凝集素分類的依據(jù)[18]。GCL血凝活性不被所測試的α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖所抑制,但被蔗糖和麥芽糖所抑制,最小抑制濃度分別為40 mmol/L和20 mmol/L。從這些單糖和二糖的結(jié)構(gòu)分析推測,葡萄糖C4上的游離羥基決定血凝活性。D-葡萄糖、γ-球蛋白的C4上都有游離羥基,但GCL不被它們抑制,可能是由于D-葡萄糖、γ-球蛋白的空間構(gòu)象不適合與GCL結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合,因此,不表現(xiàn)出對GCL血凝活性的抑制作用,據(jù)此推測GCL的結(jié)合位點(diǎn)可能是一個可容納與其互補(bǔ)的雙糖的裂隙,麥芽糖比蔗糖更有利于與GCL的結(jié)合。Toxopneustidpileolus球形叉棘凝集素是一個半乳糖專一的凝集素[5],紫海膽卵凝集素是一個半乳糖苷專一的凝集素[7],光棘球海膽體腔液凝集素為甘露糖專一的凝集素[8],均與海刺猬體腔液凝集素不同。

2.8 色氨酸的化學(xué)修飾

當(dāng)NBS加入量達(dá)到100μL后,A280nm值不再下降 (圖6),根據(jù)計算,GCL分子中有5.1個Trp被修飾,修飾后GCL對兔紅細(xì)胞的血凝活性喪失75%(表4),表明Trp殘基是GCL血凝活性的重要組成部分。

圖6 GCL的NBS滴定曲線Fig.6 Titration curve of GCL by NBS

表4 N-溴代丁二酰亞胺對GCL血凝活性的影響Tab.4 The effects of NBS on hemagglutinating activity ofGCL

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Purification,properties and chem icalmodification of tryptophan residues in lectin from coelom ic fluid of
sea urchin Glyptocidaris crenularis

LIDan-tong1,2,WU Zhen-hai1,2,LIYue1,2,WANG Shu-min1,2,ZHU Ying1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

A lectin(GCL)was purified from coelomic fluid of sea urchin(Glyptocidariscrenularis)by DEAE-cellulose 52 ion exchange chromatography and gel filtration chromatography with Sephadex G-200.The lectin showed a single band on both reduced and non-reduced SDS-PAGE withmolecular weight of94 462,hemagglutinating the four tested erythrocytes(rabbit,dog,chicken and O type erythrocyte in human),especially to rabbitand dog erythrocytes,without hemagglutinating erythrocytes of human(A,B,AB)and crucian carp(Carassiusauratus). Themaximum hemagglutinating activity was observed at4-33℃ and at pH 7.5-8.5,being reduced to 25%at36℃ for 10 minutes.No activity was found 10 minutes after 48℃ incubation.The hemagglutination activity of GCL was significantly inhibited by divalentmetal ion Mg2+and EDTA,except for Ca2+.The hemagglutinating activity of GCL was significantly inhibited by sucrose atminimum inhibitory concentration of about40 mmol/L and bymaltose atminimum inhibitory concentration of 20 mmol/L.α-Lactose,D-Fructose,D-Galactose,D-Mannitol,D-Glucose andγ-Globulin showed little effect on the hemagglutination activity of GCL.Chemicalmodification of tryptophan(Trp)residueswith N-Bromosuccinimide(NBS)showed that 5.1 tryptophan(Trp)residuesmodified in GCL,being accompanied by 75%loss of hemagglutinating activity,indicating that Trp residues played an important part in GCL hemagglutinating activity.

Glyptocidariscrenularis;lectin;purification;chemicalmodification

S917

A

2095-1388(2012)04-0338-06

2012-05-18

遼寧省教育廳團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 (2008T021)

李丹彤 (1965-),女,教授。E-mail:lidantong@dlou.edu.cn