一株沿海灘涂細(xì)菌的降油及生長(zhǎng)特性研究

王斌周雅飛張興鄭峰偉高鈺婷何潔周一兵

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

一株沿海灘涂細(xì)菌的降油及生長(zhǎng)特性研究

王斌1、2,周雅飛1,張興1,鄭峰偉1,高鈺婷1,何潔1,周一兵1、2

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

采用以原油為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,從原油污染的沿海灘涂土壤中分離篩選具有降油性能的細(xì)菌;采用柴油培養(yǎng)基測(cè)定分離菌株對(duì)柴油的原始降解率;通過在柴油培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖 (0、1、2、4、8、16 g/L),及不同濃度的酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨 (以氮計(jì),濃度為0.5、1、2 g/L)和磷酸二氫鈉 (0、4、8、12 g/L)后,測(cè)定分離菌株的降油性能;鑒定分離菌株并研究其生長(zhǎng)特性。結(jié)果表明:共分離到5株能以原油為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌,其中1株原始降油率最高 (19.0%),編號(hào)為Y-3;在添加1 g/L以上葡萄糖時(shí),Y-3菌株降油率升高,添加4 g/L葡萄糖時(shí)達(dá)最高 (79.9%);酵母膏和蛋白胨可提高Y-3菌株的降油率,尿素、硫酸銨和磷酸鹽對(duì)降油率影響不明顯;根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析,確定Y-3菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonasputida,Y-3菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30℃,最適生長(zhǎng)pH為8,適宜生長(zhǎng)NaCl濃度為0～30 g/L。

石油降解菌;生理生化鑒定;16S rDNA序列分析;生長(zhǎng)特性

海上溢油事故的不斷發(fā)生導(dǎo)致海洋環(huán)境的石油類污染成為世界性的問題,由此造成了部分海灣環(huán)境惡化、生物絕跡[1-2]。石油污染常用的修復(fù)方法有物理、化學(xué)和生物修復(fù),其中生物修復(fù)對(duì)人和環(huán)境造成的影響小且修復(fù)費(fèi)用僅為物理、化學(xué)修復(fù)的30% ～50%[3]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物降解石油的研究非常廣泛,應(yīng)用于海洋溢油的降解菌也有較多報(bào)道[4-8]。在修復(fù)環(huán)境中接種的外源微生物面臨多重壓力:一是土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用,二是環(huán)境中生態(tài)因子的適宜性,三是被修復(fù)環(huán)境中污染物的環(huán)境毒性。由于這幾方面的壓力使接種的外源微生物的存活率很低或活性較弱,限制了其應(yīng)用效果[4-9],研究細(xì)菌的降油性能及其在原位修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)。本研究中,作者從原油污染的沿海灘涂土壤中分離篩選石油降解菌,同時(shí)研究添加不同營(yíng)養(yǎng)素后細(xì)菌的降油性能,以期為海洋溢油的生物處理提供更多的材料及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 土壤樣品采自遼寧省盤錦市原油污染的灘涂,24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。原油樣品采自盤錦油田,柴油樣品為市售0號(hào)柴油。1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基包含NaCl 10 g,NH4Cl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41 g,KCl 0.01g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.002 g, FeSO40.01 g,蒸餾水1 L,pH為7.2,在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。分離富集培養(yǎng)基為100 mL基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2 g原油,在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。生長(zhǎng)特性及菌種保存培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(或平板)和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。柴油培養(yǎng)基為100 mL滅菌后的基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.1 mL市售0號(hào)柴油(115℃下滅菌30min)。營(yíng)養(yǎng)素添加培養(yǎng)基為100mL基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的葡萄糖、氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸銨)、磷酸二氫鈉,在115℃下滅菌30 min后,再加入滅菌后的柴油。

1.2 方法

1.2.1 降油菌株的分離及篩選 取土壤樣品10 g加入到盛有90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,振搖約20 min使樣品與水充分混合,靜置后取上清液10 mL,加入到盛有100 mL富集培養(yǎng)基(含原油20 g/L)的三角燒瓶中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)液梯度稀釋,涂布到分離富集培養(yǎng)基平板上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,取單菌落經(jīng)多次分離純化后,轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株原始降油率的測(cè)定 將保存的分離菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,在25℃下培養(yǎng)24 h,取2 mL濃度為109cell/mL的菌懸液(顯微直接計(jì)數(shù))接種到100 mL柴油培養(yǎng)基中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,每株細(xì)菌各設(shè)3個(gè)平行。在SPECTRUM754型紫外分光光度計(jì)上掃描柴油的最大吸收波長(zhǎng),在最大波長(zhǎng)處測(cè)得各組樣品的OD值,按下式計(jì)算降油率:

降油率 (D)= (A0-Ai)/A0×100%,

其中:A0為對(duì)照組5 d后殘余柴油的吸光度;Ai為試驗(yàn)組5 d后殘余柴油的吸光度。然后取其平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,復(fù)篩出降油率較高的菌株[10-11]。

1.2.3 添加碳、氮和磷后菌株降油率的測(cè)定 選擇原始降油率最高的分離菌株用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基在25℃下培養(yǎng)24 h,然后分別接種2 mL菌懸液 (濃度為109cell/mL)到100 mL含不同濃度葡萄糖(0、1、2、4、8、16 g/L),不同濃度的氮源,包括酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸銨 (以氮計(jì),濃度分別為0.5、1、2 g/L),不同濃度的磷酸二氫鈉(0、4、8、12 g/L)柴油培養(yǎng)基中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,同法測(cè)定柴油含量并計(jì)算平均降油率,每個(gè)梯度各設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4 菌株的鑒定 根據(jù) 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,對(duì)復(fù)篩所得降油性能最好的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[12-13],并送寶生物工程 (大連)有限公司測(cè)定16S rDNA序列,將測(cè)序結(jié)果在Gen-Bank中進(jìn)行比對(duì),并使用Mega 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以此確定其分類位置。

1.2.5 菌株的生長(zhǎng)特性

1)適宜生長(zhǎng)溫度 將篩選所得降油性能最佳的菌株采用 “1.2.3”中的方法培養(yǎng)后,挑取一環(huán)接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,分別在4、10、20、25、30、37、40℃下靜置培養(yǎng)24 h,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行。以不接種菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照,測(cè)定各試驗(yàn)組的菌體密度 (OD600nm)。

2)適宜生長(zhǎng)NaCl濃度 接種試驗(yàn)菌株到含NaCl為0、10、20、30、40 g/L的牛肉膏蛋白胨水中,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行,在25℃、150 r/min條件下培養(yǎng) 24 h,測(cè)定各試驗(yàn)組的菌體密度(OD600nm)。

3)適宜生長(zhǎng)pH 測(cè)定試驗(yàn)菌株在pH為5、6、7、8、9、10的牛肉膏蛋白胨水中的菌體密度(OD600nm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 石油降解菌的分離、篩選

經(jīng)富集培養(yǎng)和分離純化共得到5株能以原油為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌,編號(hào)分別為Y-1、Y-2、Y -3、Y-4、Y-5,其形體特征見表1。盡管原始分離菌株能在以原油為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),但其對(duì)油的利用能力差異極大。因此,選擇以柴油為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基對(duì)分離菌株的降解能力進(jìn)行測(cè)定,復(fù)篩出降油率最高的菌株進(jìn)行深入研究。

表1 分離菌株的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of the isolated strains

2.2 分離菌株的原始降油性能

在紫外分光光度計(jì)上對(duì)柴油進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)掃描,得到最大吸收波長(zhǎng)為221 nm。在此波長(zhǎng)下,測(cè)得各組的分光光度值,得出降油率最高(19.0%)為Y-3菌株 (圖1),并以Y-3菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 Y-3菌株在添加碳、氮和磷后的降油性能

添加不同濃度的葡萄糖后,Y-3菌株的降油率均有所提高,當(dāng)葡萄糖濃度為4 g/L時(shí),降油率可提高到79.9%,說明補(bǔ)充葡萄糖對(duì)Y-3菌株的降油性能有明顯的促進(jìn)作用 (P＜0.01);添加酵母膏和蛋白胨,可明顯提高Y-3菌株的降油率,并隨添加濃度的升高降油率有上升的趨勢(shì)(P＜0.01),但尿素、硫酸銨和磷酸鹽對(duì)Y-3菌株的降油性能作用不明顯(P＞0.05),如圖2、圖3所示。

圖1 分離菌株的原始降油率Fig.1 Original degradation rate of the crude oil by the isolated strains

圖2 葡萄糖濃度和NaH2PO4濃度對(duì)降油率的影響Fig.2 Impact of the concentrations of glucose and NaH2PO4on oil degradation

圖3 不同氮源及其濃度對(duì)降油率的影響Fig.3 Impact of the nitrogen sources and concentration on oil degradation

圖4 電鏡下Y-3菌株的形態(tài) (15 000×)Fig.4 Electronic scopy m icrograph of the Y-3(15 000×)

2.4 Y-3菌株的鑒定

1)形態(tài)學(xué)特征 Y-3菌株為革蘭氏陰性短桿菌,無(wú)芽孢;菌落圓形,光滑,直徑為2～3 mm,乳白色,具運(yùn)動(dòng)性;電鏡下見單極生鞭毛 (圖4)。

2)生理生化鑒定 通過對(duì)Y-3菌株進(jìn)行生理生化鑒定,結(jié)果顯示,其與惡臭假單胞菌Pseudomonasputida特征相符 (表2)。

將Y-3菌株的16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果輸入GenBank進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與惡臭假單胞菌的同源性達(dá)到100%,使用Mega 5軟件構(gòu)建Y-3菌株與假單胞菌屬Pseudomonas屬內(nèi)其它菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,表明Y-3菌株與惡臭假單胞菌聚為一枝 (圖5)。綜上所述,可確定Y-3菌株為惡臭假單胞菌。

2.5 Y-3菌株的生長(zhǎng)特性

從圖6可見:Y-3菌株最適生長(zhǎng)溫度為30℃; Y-3菌株在NaCl濃度為0～30 g/L時(shí)生長(zhǎng)情況相差不大,在40 g/L時(shí)生長(zhǎng)驟減,表明該菌株可耐鹽生長(zhǎng);最適生長(zhǎng)pH為8。

3 討論

本研究中從分離獲得的幾株原油降解菌中選擇原始降油率相對(duì)較高的Y-3菌株,進(jìn)行了不同營(yíng)養(yǎng)素添加后對(duì)柴油降解性能的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)添加少量葡萄糖可明顯提高其對(duì)柴油的降解能力,提高幅度優(yōu)于添加不同有機(jī)氮。細(xì)菌的原始降油率通常不高[14-16],有學(xué)者認(rèn)為石油可提供微生物碳源,但N、P營(yíng)養(yǎng)的缺乏往往是影響細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的主要原因,補(bǔ)充氮源有助于提高原始降油率[17-18]。本研究中發(fā)現(xiàn),有機(jī)氮可提高試驗(yàn)菌對(duì)柴油的降解率,但添加葡萄糖對(duì)分離菌降油率的提升作用強(qiáng)于添加各種氮源,此種現(xiàn)象目前鮮見報(bào)道。微生物在降解環(huán)境特殊污染物質(zhì)的過程中存在 “共代謝”作用[19],關(guān)于 “共代謝”的研究目前多見于環(huán)境廢水中特殊難降解物質(zhì)的微生物代謝過程[20-21]。鑒于Y-3菌株對(duì)柴油的原始降解率較低,而在添加基礎(chǔ)碳源后其降油率明顯提高,推測(cè)Y-3菌株對(duì)柴油中的某些成分可能存在 “共代謝”現(xiàn)象,這為今后利用微生物在原位或異位石油污染修復(fù)過程中,提高菌體的降油效能提供了新的立足點(diǎn),Y -3菌株對(duì)柴油中哪些成分存在 “共代謝”還有待于深入的研究。

圖5 Y-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Y-3

表2 Y-3菌株的生理生化特征Tab.2 Biochem ical and physiological characteristics of thestrain Y-3

圖6 Y-3菌株適宜生長(zhǎng)溫度、NaCl濃度和pHFig.6 The optimal tem perature,NaCl concentration,and pH for Y-3 grow th

本研究中分離的Y-3菌株經(jīng)生理生化特征和16S rDNA序列測(cè)定及比對(duì),鑒定為惡臭假單胞菌。有關(guān)假單胞菌屬降解石油的報(bào)道很多[11,6-7,22],但大多未鑒定到種。關(guān)于惡臭假單胞菌對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴、多環(huán)芳香烴等降解機(jī)制的研究較多,但對(duì)其在石油污染修復(fù)中應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究中報(bào)道的Y-3菌株生長(zhǎng)的溫度、NaCl濃度、pH范圍均適合海洋環(huán)境,因此,Y-3菌株可作為海洋石油污染修復(fù)菌種進(jìn)行研究和開發(fā),尤其對(duì)于石油各組分的降解能力及代謝機(jī)制,降解基因的存在方式及其調(diào)控機(jī)制是今后研究的重點(diǎn)。

[1] 曲維政,鄧聲貴,岳淑紅,等.海洋石油污染對(duì)海氣正常交換過程的破壞性影響[J].自然災(zāi)害學(xué)報(bào),2002,11(4):55-59.

[2] 陳建秋.中國(guó)近海石油污染現(xiàn)狀、影響和防治[J].節(jié)能與環(huán)保,2002,30:15-17.

[3] Hicks B N,Caplan JA.Bioremediation:A natural solution[J]. Pollution Engineering,1993,25(2):30-33.

[4] 夏文香,鄭西來,李金成,等.海灘石油污染的生物修復(fù)[J].海洋環(huán)境科學(xué),2003,22(3):74-79.

[5] 丁明宇,黃健,李永祺,等.海洋微生物降解石油的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(1):84-88.

[6] 邵宗澤,許嘩,馬迎飛,等.2株海洋石油降解細(xì)菌的降解能力[J].環(huán)境科學(xué),2004,25(5):133-137.

[7] 田勝艷,劉廷志,高秀花,等.海洋潮間帶石油烴降解菌的篩選分離與降解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,25(S1):301-305.

[8] 謝鯤鵬,周集體,曲媛媛,等.一株耐鹽原油降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].海洋環(huán)境科學(xué),2009,28(6):680-683.

[9] 夏北成.環(huán)境污染物生物降解[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002:222-385.

[10] GB17378.4—2007,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分:海水分析[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[11] 王戰(zhàn)勇,顧貴洲,蘇婷婷,等.石油降解菌株P(guān)seudomonassp. DY12的篩選及降解性能研究[J].化學(xué)與生物工程,2009,26 (8):67-87.

[12] 沈萍,陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社, 2007:110-120.

[13] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:370-384.

[14] 楊雪連,李鳳梅,劉婉婷,等.高效石油降解菌的篩選及降解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2008,72(1):230-233.

[15] 李玉素,李法云,張志瓊,等.遼河油田凍融石油污染土壤中原位修復(fù)微生物[J].遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,27(4): 599-601.

[16] 陳璧娥,劉祖同.湄洲灣海洋細(xì)菌降解石油烴研究[J].石油學(xué)報(bào),2001,17(5):31-35.

[17] Oh Y S,Sim D S,Kim S J,et al.Effects of nutrients on crude oil biodegradation in the upper intertidal zone[J].Marine Pollution Bulletin,2001,42(12):1367-1372.

[18] 田勝艷,王娟,聶立紅,等.兩種N源對(duì)石油烴降解菌群降解柴油能力的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué),2009,28(1):26-29.

[19] Arp D J,Yeager C M,Hyman M R,et al.Molecular and cellular fundamentals of aerobolic cometabolism of trichloroethylene[J]. Biodegradation,2001,12(2):81-103.

[20] 瞿福平,張曉健,何苗,等.氯苯類有機(jī)物生物降解性及其代謝作用研究[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),1997,17(2):142-146.

[21] Saul M T.Aerobic comatabolism of halogenated aliphatic hydrocarbons:A technology overview[J].Remediation Journal,2007, 11:29-36.

[22] 徐馮楠,馮貴穎,馬雯,等.高效石油降解菌的篩選及其降解性能研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2010(7):221-226.

The grow th and petroleum degradation characteristics of bacteria in coastal beach

WANG Bin1,2,ZHOU Ya-fei1,ZHANG Xing1,ZHENG Feng-wei1,GAO Yu-ting1,HE Jie1,ZHOU Yi-bing1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalain Ocean University,Dalian 116023,China)

The bacteria that have capability to degrade crude oil were isolated from the coastal beach polluted by crude oilwith the basalmedium crude oil as only carbon source.The original degradation rate of diesel oil by the isolated strains was determined.In addition,the degradation rate of diesel oil by the isolated strain was determined with the basalmedium diesel oil including different concentration of glucose(0,1,2,4,8,16 g/L),the different concentrations of yeast extract,peptone,carbamide,(NH4)2SO4(according to the content of nitrogen:0.5, 1,2 g/L)and NaH2PO4(0,4,8,16 g/L).The isolated strain was identified and growth characteristicswere studied.The results showed:5 strains bacteria grew on the basalmedium crude oil as only carbon source.One of these stains had amaximum original degradation rate(19.0%)and was numbered as Y-3.The degradation rate of Y-3 increased and reached to 79.9%in the diesel oilmedium supplemented with glucose(4 g/L).The degradation rate was increased in Y-3 in addition of yeastextractand peptone also,butnotnotable in added urea,(NH4)2SO4and NaH2PO4.The Y-3 was identified asPseudomonasputidaaccording to the resultof themorphology,physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The Y-3 had fitting growth at temperature of 30℃,pH 8, and NaCl concentration of 0-30 g/L.

diesel oil;biodegradation;bacterial identification;growth characteristics

X172

A

2095-1388(2012)04-0306-05

2012-12-01

國(guó)家 “863”計(jì)劃項(xiàng)目 (2006AA10Z410);國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目 (200805069)

王斌 (1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn

周一兵 (1957-),男,教授。E-mail:ybzhou@dlou.edu.cn