EGF誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖及其作用機(jī)制

陳少卿，汪小浪

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006）

原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命及健康，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60多萬，居惡性腫瘤的第5位，東亞及環(huán)太平洋地區(qū)是肝癌高發(fā)地區(qū)，我國新發(fā)肝癌人數(shù)占全球人數(shù)一半以上；我國發(fā)病率高的原因在于我國乙肝患病人數(shù)多，丙型肝炎的發(fā)病率近年亦有明顯的上升趨勢，肝癌多在乙肝、丙肝等慢性肝炎后肝硬化的基礎(chǔ)上產(chǎn)生；肝癌的治療手段主要是手術(shù)切除、介入治療、靶向治療及中醫(yī)治療等方法，但由于原發(fā)性肝癌治療的敏感性差，且大部分患者就診時(shí)已經(jīng)晚期，因此，預(yù)后非常差，1995年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，我國肝癌年死亡率已達(dá)20.4/10萬人，僅次于胃癌，居第2位[1-3]。因此，揭示肝癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程中異常信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,可以為肝癌的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

表皮生長因子（EGF）是生長因子家族的主要成員之一，屬于胞外信息物質(zhì)，其作用方式是通過與靶細(xì)胞上特異性表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合，從而誘導(dǎo)受體自身磷酸化，活化的EGFR可激活眾多的下游信號途徑，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[4]。EGFR又稱C-erbB受體，基因位于7q11.13，具有酪氨酸蛋白激酶活性。EGFR結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分[5]，胞外區(qū)與配體結(jié)合而被激活，通過胞內(nèi)側(cè)激酶反應(yīng)將胞外信號傳至胞內(nèi)，經(jīng)下游信號傳導(dǎo)途徑影響細(xì)胞的增殖分化。本研究通過觀察EGF對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響，初步探討C-erbB2在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2（上海鑫閔生物科技有限公司），EGF（Sigma），Trizol（Takara），Taq 酶（Promega），DEPC（博大泰克產(chǎn)品），Marker（Promega），OligdT（Promega），MMLV 逆轉(zhuǎn)（Promega）。β-Actin 引物序列:上游 5’-GTGGGCCGCTCTAGGCA-3’，下游 5’-CTCTTT-GATGTCAGCACGA-3’，擴(kuò)增片段長度243 bp（上海生物工程中心合成）；C-erbB2引物序列：上游 5’-AGCTGCACTGTGGATGTCAG-3’，下游 5’-GAGCCTTCGGCACTGTCTAC-3’，擴(kuò)增片段長度201 bp（上海生物工程中心合成）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。取對數(shù)生長的肝癌細(xì)胞，胰酶消化接種后，在無血清DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱培養(yǎng)8 h，需藥物處理的4組分別加入EGF至終濃度分別為 0.1、1、10、100 μg·L-1，對照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.2.2 MTT增殖指數(shù)

按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板,分別以不同濃度的EGF加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，加入5 g·L-1的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄上清，加入DMS0 200μL，搖晃 5 min，取 150μL加入 96孔板中。在酶標(biāo)儀波長492 nm處測A值。設(shè)4個(gè)復(fù)孔。根據(jù)MTT結(jié)果、酶標(biāo)法觀測肝癌細(xì)胞株吸光度值。

1.2.3 RT-PCR檢測

1）總RNA的提?。簩⑴囵B(yǎng)的1×107肝癌細(xì)胞分為對照組、EGF組。加入0.5mL Trizol，劇烈震蕩后加 0.1 mL氯仿，劇烈搖晃 15 s，以 10 000 g，4℃離心20min。轉(zhuǎn)移水相，加預(yù)冷的異丙醇，放置10min，10 000 g，4℃離心20min，離心后在管底見RNA膠片狀沉淀。經(jīng)75%的乙醇洗脫后，RNA沉淀物在室溫下自然干燥，用0.1%的DEPC水15μL溶解后56℃水浴10min。

2）逆轉(zhuǎn)錄：提取的總 RNA 加入 3 μL Olig（dT），70℃孵育5min后置于冰上5min。依次加M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL、M-MLV Buffer 5 μL、Rnase inhibitor 1μL、Dntp 1.5μL，DEPC水加至 25μL，37℃水浴 60 min，合成 c-DNA。

3）PCR：反應(yīng)體系為 c-DNA 5 μL、上下游引物（目的引物和 β-Actin）各 1 μL、dNTP 1.5 μL、10×Buffer 5 μL、25 mmol MgCl21 μL、Taq 酶 0.5 μL，加DEPC水至50μL。簡單離心后上覆石蠟油50μL。94℃預(yù)變性 5min后，PCR 程序?yàn)椋?4℃ 60 s，56℃55 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)延伸5min結(jié)束。

4）瓊脂糖凝膠電泳：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和Marker在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30min（電壓為100 V），最后在自動凝膠成像系統(tǒng)下觀察、照相并分析。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

利用自動凝膠成像系統(tǒng)，C-erbB2 mRNA的表達(dá)水平用相對量表示，即C-erbB2 mRNA條帶密度掃描數(shù)值除以本組內(nèi)對照β-Actin的掃描數(shù)值求得一個(gè)相對比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EGF對肝癌細(xì)胞系HepG2增殖作用的影響

10μg·L-1EGF組的吸光度 A值比對照組高22.2%（P<0.05），比 0.1 μg·L-1EGF 組高 20.5%（P<0.05），比 1 μg·L-1EGF 組高 13.0%（P<0.05），和 100 μg·L-1EGF組的吸光度A值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。結(jié)果提示，EGF可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖，并與其劑量有關(guān)。

圖1 各組吸光度A值比較

2.2 C-erbB2 m RNA在EGF誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖中的表達(dá)變化

選取10μg·L-1為EGF的最佳作用濃度，將細(xì)胞株分成2組，分別為對照組和EGF組。利用RTPCR技術(shù)測定各組C-erbB2mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在Marker為297、210 bp的電泳條帶之間，可見擴(kuò)增片段長度為243 bp的β-actin的電泳條帶。在210 bp的Marker電泳條帶附近，對照組、EGF組均可見擴(kuò)增長度為201 bp的電泳條帶。而且EGF組的條帶明顯亮于對照組 （圖2）。分別用各組C-erbB2 mRNA條帶光密度值除以本組內(nèi)對照β-Actin的光密度值發(fā)現(xiàn)，EGF組、對照組的比值分別為1.14、0.39（圖 3），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示，EGF可以增強(qiáng)C-erbB2mRNA的表達(dá)。

圖2 2組C-erbB2mRNA的表達(dá)

圖3 2組C-erbB2mRNA光密度比值分析

3 討論

EGF是Cohen于1962年首次從成年雄鼠的頜下腺分離提純的一種單鏈多肽[6]。它是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分裂促進(jìn)因子，能促進(jìn)體內(nèi)多種細(xì)胞的分裂和增殖。一般認(rèn)為其作用于細(xì)胞膜EGFR，激活氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)信使三磷酸肌醇（IP3）或Ca2+等的參與下，作用于與細(xì)胞生長、增殖有關(guān)的蛋白質(zhì)或因子，從而調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄。EGFR家族由4個(gè)成員C-erbB1、C-erbB2、C-erbB3及 C-erbB4組成，是受體型的酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine protein kinase，RPTK）。EGF對人正常肝細(xì)胞的增殖有明顯的作用，其主要是通過調(diào)節(jié)EGFR的數(shù)量和代謝等環(huán)節(jié)刺激DNA的合成，從而刺激肝細(xì)胞的增殖[7]。但對肝癌細(xì)胞的作用目前研究尚不一致。有人認(rèn)為EGF對癌細(xì)胞的生長起促進(jìn)作用，它可以使正常細(xì)胞惡變[6]，在卵巢癌及乳腺癌中，C-erbB2 的高表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)[8-9]。但也有人認(rèn)為EGF對腫瘤的生長起抑制作用，體外撤去長期作用的EGF，可使正常的細(xì)胞惡變，說明EGF可維持細(xì)胞的正常性狀[10]?？梢?，EGF對肝癌細(xì)胞的作用尚不明確，其中的作用機(jī)理亦未明了。

本文研究發(fā)現(xiàn)，EGF能呈劑量依賴方式誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖，和戚之琳等[11]報(bào)道的一致，10μg·L-1EGF可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞系HepG2 C-erbB2mRNA的表達(dá)，其機(jī)制可能與上調(diào)原癌基因C-erbB2的表達(dá)有關(guān)。曲嫻等[12-13]報(bào)道EGF與其受體結(jié)合后，能刺激腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。所以EGFR信號途徑與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和抗凋亡作用之間存在著一定的聯(lián)系。分析原因，可能是C-erbB2胞外段結(jié)合EGF后，引發(fā)變構(gòu)形成二聚體，激活RPTK，引起胞內(nèi)段酪氨酸自身磷酸化。后者催化多種底物酪氨酸殘基磷酸化，從而啟動、催化與肝癌細(xì)胞生長、增殖有關(guān)的生化過程[14]。戚之琳等[11]在實(shí)驗(yàn)中觀察到EGF能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和體外遷移能力,而MAPK信號通路抑制劑PD98059對肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力則具有抑制作用，RT-PCR結(jié)果表明EGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是上調(diào)了肝癌細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)水平。戚之琳等[11]認(rèn)為EGF還可能通過MAPK信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及遷移侵襲，Survivin基因表達(dá)的改變可能是通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而實(shí)現(xiàn)的，EGF/MAPK信號通路可以作為肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，為臨床肝癌的治療提供了新的思路。然而，EGF調(diào)控肝癌細(xì)胞株增殖的其他信號通路有待于進(jìn)一步研究。

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