不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后過氧化氫及其氧化酶的表達(dá)差異1)

馬 健

(國家林業(yè)局森林生態(tài)學(xué)與森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所)，北京，100091)

劉振宇 呂 全 梁 軍 嚴(yán)東輝 張星耀

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)) (國家林業(yè)局森林生態(tài)學(xué)與森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所)

楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea(Moug.Ex，F(xiàn)r.)Ces.＆ de Not.) 是 我 國 楊 樹 (Populus spp.)的重要枝干病害［1-3］。該病害近年來地理分布和寄主范圍不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重阻礙我國楊樹的發(fā)展。為了進(jìn)一步控制楊樹潰瘍病，對(duì)于楊樹抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究是十分必要的。過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)作為植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中新組分的發(fā)現(xiàn)，使H2O2與植物抗病性的研究成為新的熱點(diǎn)。研究表明，H2O2可以作為第二信使誘導(dǎo)防御反基因的表達(dá)，從而使植物表現(xiàn)出抗性，是植物抗病反應(yīng)中激活相關(guān)防御基因的主要信號(hào)分子［4-5］。隨著植物體內(nèi)H2O2的積累，其清除系統(tǒng)中的抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)等酶的活性也隨植物抗病性的不同而具有顯著差異。同時(shí)，理永霞等［3］對(duì)楊樹接種B.dothidea后蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)楊樹接種潰瘍病菌后APX與POD差異表達(dá)，說明這兩種蛋白在植物防御應(yīng)答中具有重要作用。為了進(jìn)一步分析 H2O2、APX和POD在楊樹抗?jié)儾∵^程中的表達(dá)情況，筆者以抗病毛白楊(Populus tomentosa)和感病北京楊(P.×beijingensis)為研究對(duì)象，探討不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，H2O2及抗病相關(guān)酶活性變化與基因表達(dá)情況，以期為有關(guān)信號(hào)分子和抗性相關(guān)基因在預(yù)防楊樹潰瘍病上的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試楊樹、菌株及接種

以1年生毛白楊(Populus tomentosa Carr.，自然狀態(tài)下感病指數(shù)為0～6.0)和北京楊(P.×beijingensis W.Y.Hsu，自然狀態(tài)下感病指數(shù) 45.1 以上)［6-7］扦插苗為試驗(yàn)材料，其扦插枝條采自中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所病理組實(shí)驗(yàn)苗圃毛白楊和北京楊植株，扦插于中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室，在相同的環(huán)境條件下，采用常規(guī)方法對(duì)苗木進(jìn)行統(tǒng)一管理，盆栽用土為V(園土)∶V(草炭土)∶V(蛭石)=1∶1∶1，溫室中晝夜溫度分別為25～27℃和18～20℃，平均日照時(shí)間12 h。

供試菌株為從北京楊潰瘍病斑上分離并保存的楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea，經(jīng)單胞培養(yǎng)鑒定，致病力中等)病原菌株。菌株在27℃條件下于PDA平板上暗培7 d，無菌條件下用滅菌打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅作為接種體備用。

針刺菌餅接種：用75%乙醇擦拭消毒，用滅菌解剖針在楊樹莖部輕刺梅花型針眼，相距約3 mm，然后將有菌絲一面朝向針眼貼緊，外被濕滅菌藥棉并用保鮮膜包扎固定接種點(diǎn)。每樹種設(shè)2個(gè)處理：針刺接種滅菌PDA培養(yǎng)基(CK)、針刺接種潰瘍病菌。實(shí)施處理后0(無針刺)、6、12、24、48、72 和96 h分別取樣，每處理每時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。取后迅速投入液氮中，并保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 H 2 O2摩爾質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考Patterson等［8］的方法，稍有改動(dòng)。取1 g樣品加5 mL冷丙酮磨成勻漿，12 000 r/min離心，上清液定容，反應(yīng)液中含0.1 mL體積分?jǐn)?shù)為20%TiCl4的濃鹽酸、0.2 mL濃氨水和1 mL上清液生成的過氧化物—Ti復(fù)合物，用丙酮洗3次，丙酮揮發(fā)后溶于3 mL 1 mol/L硫酸中，410 nm下測(cè)光吸收值，按同樣程序制H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 H2O2的亞細(xì)胞定位

H2O2細(xì)胞化學(xué)定位根據(jù)Bestwick等［9］的方法。取樣部位為離病斑0.5 cm處樹皮進(jìn)行取樣，取樣時(shí)用鋒利的刀片取離苗木接種點(diǎn)周圍小于1～2 cm2的樹皮。把樣品放在新制備的5 mmol/L CeCl3中真空滲透1 h。前固定：把莖塊放在固定液(體積分?jǐn)?shù)2%戊二醛+體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛)中，室溫固定1 h，并在4℃條件下過夜。固定后，莖塊用二甲砷酸鹽緩沖液(CAB)漂洗2次，每次10 min。后固定：把莖塊放存體積分?jǐn)?shù)1%的四氧化鋨固定液中，固定45 min。固定后再用CAB緩沖液漂洗2次，每次10 min。脫水：吸去緩沖液，注入乙醇，逐級(jí)梯度脫水。浸透：把樣品放在氧化丙烯中浸透2次，每次20 min。包埋：逐步用Eponaraldite包埋樣品。然后無染色看片。透射電鏡加速電壓80 V，切片厚度50～100 nm。

1.4 酶活性測(cè)定

酶活性測(cè)定參考現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［10］中的實(shí)驗(yàn)方法，稍有改動(dòng)。

1.4.1 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測(cè)定

接種后于各時(shí)段取樣品，參照Nakano等［11］的方法測(cè)定APX酶的活性，略作改進(jìn)。取1 g樣品加入50 mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，冷凍離心(12 000 r/rain，20 min)后，取上清液備用。3 mL的反應(yīng)體系中含50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0，0.1 mmoL/L EDTA-Na2)，0.3 mmol/L AsA，0.06 mmoL/L H2O2和0.1 mL酶液。加入 H2O2后，立即在20℃下用分光光度計(jì)測(cè)定10～30 s內(nèi)290 nm波長(zhǎng)下吸光值。

1.4.2 過氧化物酶(POD)活性測(cè)定

參照Hammerschmid［12］的方法對(duì)各處理樣品的POD酶活性進(jìn)行測(cè)定，每處理測(cè)定3次，以每克鮮質(zhì)量每分鐘增加0.1個(gè) OD值為酶活單位(U·min-1·g-1)。

將所獲各處理數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Real－time PCR 分析

1.5.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

RNA提取試劑盒(Bioteke公司)提取樣品的總RNA，TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法按照說明書進(jìn)行。將所獲得的RNA和cDNA分別儲(chǔ)存于-80℃和-20℃的冰箱中備用。

1.5.2 RT－PCR 引物設(shè)計(jì)與篩選

利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，見表1。

表1 毛白楊和北京楊接種潰瘍病菌后APX和POD RTPCR分析所用引物

1.5.3 目的基因的RT－PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋20倍作模板，按下列組分配制PCR反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)：SYER Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.5 μL，模板 2.0 μL，H2O9.0 μL。

本次實(shí)驗(yàn)使用TAKARA公司SYBR?Premix Ex Taq TM(Perfect Real Time)試劑。Real-Time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s;接下來是40個(gè)循環(huán)，95℃變性5 s，60℃退火34 s;每個(gè)樣品3次重復(fù)，PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。儀器：ABI 7500 Real-time PCR System。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性楊樹接種B.dothidea后H2O2摩爾質(zhì)量濃度變化

2種不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，其體內(nèi)H2O2摩爾質(zhì)量濃度差異顯著，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種楊樹在健康狀態(tài)下(CK)H2O2摩爾質(zhì)量濃度變化不明顯，見表2。

表2 不同接種時(shí)間后潰瘍病菌對(duì)不同抗性楊樹中H2O2摩爾質(zhì)量濃度的影響

接種B.dothidea后，抗病和感病楊樹H2O2摩爾質(zhì)量濃度均先上升后下降，但變化幅度存在明顯差異。毛白楊H2O2摩爾質(zhì)量濃度顯著高于北京楊，在接種后24～72 h時(shí)的H2O2摩爾質(zhì)量濃度顯著高于北京楊。72h時(shí)，毛白楊達(dá)到最高峰(P＜0.000 1)，而北京楊48 h時(shí)達(dá)到高峰，H2O2摩爾質(zhì)量濃度分別為 737.52 mol/g和 306.99 mol/g，比相應(yīng)對(duì)照(CK)分別增加10.03倍和3.08倍，見表2。

2.2 H2O2細(xì)胞化學(xué)定位

為進(jìn)一步研究H2O2的系統(tǒng)性產(chǎn)生，用CeCl3染色的細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)楊樹韌皮部H2O2積累情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。當(dāng)孵育液中不加底物CeCl3時(shí)，未能觀察到黑色顆粒狀沉淀(圖1A、D)，因此，本試驗(yàn)中CeCl3沉淀顆粒多少以及著色深淺為H2O2摩爾質(zhì)量濃度的真實(shí)反映。從圖1B、E可以看出，接種潰瘍病菌72 h時(shí)，在電鏡下明顯觀察到，抗病毛白楊細(xì)胞壁兩側(cè)有H2O2的積累，增加的沉淀顆粒主要位于細(xì)胞壁上(圖1C)，表明毛白楊接種潰瘍病菌后，顯著誘導(dǎo)了楊樹韌皮部細(xì)胞中H2O2的積累;與抗病毛白楊相比，感病北京楊中H2O2-CeCl3沉淀顆粒很少，與應(yīng)用植物生理學(xué)方法測(cè)定H2O2摩爾質(zhì)量濃度的結(jié)果保持一致。初步推測(cè)楊樹中H2O2可能被病原菌誘導(dǎo)系統(tǒng)性產(chǎn)生，且起源于細(xì)胞壁。

2.3 潰瘍病菌侵染楊樹后抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性變化及APX基因的表達(dá)

2.3.1 APX 的活性變化

毛白楊在接種B.dothidea后，其體內(nèi)APX活性呈升高變化趨勢(shì)(表2)，相對(duì)于對(duì)照(CK)升高幅度為33.91%～350.37%，72 h時(shí)達(dá)到最大值(708.39 U·min-1·g-1)，相對(duì)于對(duì)照(CK)增加 350.37%;隨后至接種96 h，毛白楊體內(nèi)的APX活性下降，下降幅度為24.34%。北京楊接種后，APX活性與對(duì)照(CK)相比差異不明顯;而未接種潰瘍病菌的抗、感兩個(gè)品種APX活性在所測(cè)定時(shí)間內(nèi)無顯著變化，始終維持在一個(gè)較低而平穩(wěn)的水平(見表2)。

可知，楊樹接種B.dothidea后，其莖部APX活性升高的幅度、峰值的高低均與楊樹的抗性有關(guān)。

2.3.2 APX 基因表達(dá)

B.dothidea對(duì)毛白楊和北京楊的APX基因均有誘導(dǎo)作用，接種后不同抗性品種在同一時(shí)間點(diǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)有顯著的差異(表3)。從表3可以看出，接種后抗病毛白楊各個(gè)時(shí)期APX基因的表達(dá)水平均明顯高于感病北京楊。毛白楊-潰瘍病菌互作中APX基因受潰瘍病菌誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，48 h表達(dá)量上調(diào)且達(dá)到最高(t=21.557，P=0.002)。而在北京楊—潰瘍病菌互作體系中APX基因也是上調(diào)表達(dá)，但是上調(diào)幅度顯著低于毛白楊。

圖1 用CeCl3染色的細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)楊樹韌皮部H2 O2的檢測(cè)

表3 不同接種時(shí)間后潰瘍病菌對(duì)不同抗性楊樹中抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的影響

表4 接種潰瘍病菌后不同抗性品種中APX基因表達(dá)差異

2.4 潰瘍病菌侵染楊樹后過氧化物酶(POD)的活性變化及POD基因的表達(dá)

2.4.1 POD 活性變化

從表4可以看出，不同抗性楊樹接種潰瘍病菌后，POD活性均呈上升趨勢(shì)。毛白楊接種B.dothidea后，其體內(nèi)POD活性與對(duì)照(CK)相比增加17.26%～166.15%;而北京楊接種后POD活性雖也呈上升趨勢(shì)，但是增加不顯著，POD活性相對(duì)于對(duì)照(CK)僅增加了5.13%～64.04%，且接種48 h后POD活性開始下降，直至趨于對(duì)照。

未接種B.dothidea的抗、感兩個(gè)品種POD活性在所測(cè)定時(shí)間內(nèi)無顯著變化，始終維持在一個(gè)較低而平穩(wěn)的水平。這說明楊樹感染潰瘍病菌后其莖部POD酶活的變化一定程度上反映了楊樹的抗病程度，POD的活性與楊樹抗病性呈正相關(guān)。

表5 不同接種時(shí)間后潰瘍病菌對(duì)不同抗性楊樹中過氧化物酶(POD)活性的影響

2.4.2 POD 基因表達(dá)

接種B.dothidea后，抗病毛白楊POD表達(dá)量相對(duì)于感病北京楊變化顯著。POD在毛白楊接種后表達(dá)量處于上調(diào)趨勢(shì)，12 h時(shí)表達(dá)量上升(t=3.834，P=0.004)，為對(duì)照的 6.41 倍;隨后 24 h 表達(dá)量下降，但48 h時(shí)表達(dá)量迅速上升并達(dá)到較高值(t=11.023，P=0.0001)，為對(duì)照的 7.47 倍，而后表達(dá)受到抑制，表達(dá)量逐漸降低。而在北京楊中POD的表達(dá)量變化處于下調(diào)趨勢(shì)，見表5。

表6 接種潰瘍病菌后不同抗性品種中POD基因表達(dá)差異

3 結(jié)論與討論

H2O2是植物與病原菌互作中最重要的活性氧物質(zhì)［4］，在植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)中，H2O2作為一種信號(hào)分子可以在病原菌侵染后迅速產(chǎn)生，植物體內(nèi)H2O2的積累及之后的過敏性反應(yīng)被認(rèn)為是植物抵御病原菌入侵的標(biāo)志之一［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明抗病毛白楊在接種B.dothidea后H2O2的摩爾質(zhì)量濃度顯著高于感病北京楊，毛白楊接種后72 h時(shí)，H2O2摩爾質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，且兩種楊樹對(duì)照(CK)中H2O2摩爾質(zhì)量濃度沒有顯著變化。這說明楊樹在受到病原菌入侵時(shí)，H2O2可能參與楊樹的抗病防御反應(yīng)，推測(cè)H2O2摩爾質(zhì)量濃度的調(diào)控對(duì)楊樹抗?jié)儾【哂兄匾淖饔?，楊樹?duì)潰瘍病的抗性與植株體內(nèi)H2O2的快速積累有關(guān)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還利用CeCl3沉淀法進(jìn)一步觀察了亞細(xì)胞水平上H2O2分布和積累的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示，抗病毛白楊在接種后72 h時(shí)，細(xì)胞壁上有大量CeCl3沉淀，初步推測(cè)楊樹中H2O2可能被病原菌誘導(dǎo)系統(tǒng)性產(chǎn)生，且起源于細(xì)胞壁。

大量研究表明，在不同抗性的植物中，抗氧化酶表達(dá)量的增加與植物抗性有關(guān)。POD和APX是植物體內(nèi)重要的氧化酶［15］，是植物防御體系的關(guān)鍵酶，在活性氧代謝等多種代謝途徑中起到關(guān)鍵作用［16-18］。這些酶的活性可間接反映植物體內(nèi)活性氧的代謝變化，與植物抗病性密切相關(guān)。本研究表明，接種B.dothidea后抗病毛白楊H2O2摩爾質(zhì)量濃度變化與APX、POD活性變化具有顯著相關(guān)性;而感病北京楊中H2O2的變化不明顯。這表明毛白楊在接種后體內(nèi)H2O2的快速積累可能誘導(dǎo)了APX、POD活性的升高。通過RT-PCR分析表明，潰瘍病菌誘導(dǎo)了兩種互作體系中楊樹APX和POD基因的表達(dá)，研究結(jié)果說明APX和POD基因表達(dá)差異是由于B.dothidea侵染后引起的，抗病品種相對(duì)于感病品種變化顯著，APX和POD參與了楊樹的抗病過程。

另有研究表明，APX是一種重要的雙氧水脫毒化的酶［17］，Agrawal等［19］報(bào)道了水稻 APX 基因的表達(dá)受稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)誘導(dǎo)，并且推測(cè)APX可能在植物的抗病過程中起重要作用。Chen等［20］證明煙草的SA結(jié)合蛋白(SA binding protein，SABP)與CAT高度同源，SA與SABP結(jié)合后阻礙其CAT活性，提高H2O2水平;除了CAT以外，沈文飚等［21］研究證明APX對(duì)H2O2的親和力要大于CAT，通過抑制APX活性提高植物體內(nèi)H2O2摩爾質(zhì)量濃度，H2O2或其他活性氧物質(zhì)可激活抗病途徑中抗病基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果可能是本實(shí)驗(yàn)中抗病毛白楊在接種前期，APX活性下降的原因之一，可能存在SA與APX結(jié)合的現(xiàn)象。同時(shí)，RT-PCR分析證明，接種后抗病毛白楊A(yù)PX基因表達(dá)在6～24 h上調(diào)不顯著，推測(cè)此時(shí)SA與SABP結(jié)合，抑制APX活性，從而導(dǎo)致了72 h時(shí)H2O2摩爾質(zhì)量濃度的激增。這說明APX與楊樹抗病過程是密切相關(guān)的，可能在楊樹防御應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，但APX與CAT在楊樹與潰瘍病互作過程中誰起到主導(dǎo)作用，還需要進(jìn)一步研究。

由此可見，不同抗性楊樹在對(duì)潰瘍病菌的防御反應(yīng)中，其體內(nèi)H2O2摩爾質(zhì)量濃度、APX與POD酶活性及基因表達(dá)的變化規(guī)律與其樹種的抗性密切相關(guān)，H2O2的積累程度在楊樹抗病反應(yīng)中具有重要的作用，但其作用的具體途徑及H2O2是否作為信號(hào)分子在楊樹—潰瘍病互作體系中作用尚需進(jìn)一步研究。

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