96-II喜樹(shù)葉片高頻率植株再生體系建立1)

董鳳麗 祖元?jiǎng)?王慧梅

(黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，哈爾濱，150025) (森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

喜樹(shù)(Camptotheca acuminata Decne.)為我國(guó)特有樹(shù)種，廣泛分布于長(zhǎng)江流域及南方各省區(qū)。其生長(zhǎng)速度快、冠形完美，材質(zhì)優(yōu)良，是良好的用材樹(shù)種及園林綠化樹(shù)種。該樹(shù)種因體內(nèi)含有抗癌和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的生物堿：喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿等而聞名，深受植物學(xué)界和醫(yī)藥學(xué)界的青睞。臨床上用于治療肝癌、胃癌、腸癌、膀胱癌卵巢癌、食道癌、早期白血病等，其療效顯著。但是由于喜樹(shù)堿在植物組織中含量低、尤其是在成熟的喜樹(shù)葉片中含量急劇下降［1］，且目前野生狀態(tài)下喜樹(shù)資源不穩(wěn)定，隨著市場(chǎng)上喜樹(shù)堿需求量的增加，生產(chǎn)上消耗的喜樹(shù)也越來(lái)越多。因此開(kāi)發(fā)優(yōu)良品種、擴(kuò)大栽種面積已勢(shì)在必行。

到目前為止，對(duì)喜樹(shù)的研究多集中在苗木的生長(zhǎng)狀況，喜樹(shù)堿的藥理作用及合成，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲得喜樹(shù)堿等方面，對(duì)喜樹(shù)的組織培養(yǎng)方面研究報(bào)道還很少。目前有關(guān)于利用喜樹(shù)的莖段［2-4］、莖尖［5-6］、種胚［7］等作為外植體建立再生體系的報(bào)道，而葉片的再生僅有一例報(bào)道［8］。

東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在1996年從美國(guó)引入喜樹(shù)新品種——96-II，并在我國(guó)南方栽種后達(dá)到引種目的。本研究從96-II喜樹(shù)離體培養(yǎng)入手，探討離體葉片再生條件，旨在建立高頻率葉片再生體系，為今后加速96-II喜樹(shù)的人工繁殖、藥用林培育及遺傳轉(zhuǎn)化提供一條新途徑。

1 材料與方法

植物材料為96-II喜樹(shù)無(wú)菌苗葉片。培養(yǎng)溫度為22～25℃，光/暗周期16/8 h，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。繼代周期為30 d。

96-II喜樹(shù)無(wú)菌苗的獲得：剪取3 a生96-II喜樹(shù)新生、未木質(zhì)化的莖段，每段含有1個(gè)側(cè)芽，用洗滌劑漂洗30 min，再經(jīng)流水沖洗1 h后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，將莖段在70%的乙醇中浸泡30 s，再用3%次氯酸鈉消毒5 min，期間不斷搖動(dòng)，然后用無(wú)菌水漂洗3～5遍，用無(wú)菌濾紙吸干，接種在WPM+6-BA1.0 mg/L培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。25 d后，切取莖段葉腋處長(zhǎng)出的新枝，接入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁。

葉片愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基篩選：以WPM、MS和B5為基本培養(yǎng)基，將無(wú)菌苗葉片切成1.0 cm×1.0 cm大小，分別接種于附加不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA和2，4-D培養(yǎng)基上，蔗糖3%，瓊脂0.7%，調(diào)節(jié)pH值5.9左右。每個(gè)組合重復(fù)處理3次，每次處理10葉片，30 d后將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)不定芽分化。根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率大小確定最適培養(yǎng)基。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體的總數(shù))×100%;

芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出芽的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%。

生根培養(yǎng)基篩選：切取96-II喜樹(shù)誘導(dǎo)出的1.5 cm以上的不定芽，接入附加不同質(zhì)量濃度NAA及IBA的WPM生根培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行根的誘導(dǎo)。每個(gè)處理10個(gè)不定芽，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的生根情況，計(jì)算生根率，篩選出96-II喜樹(shù)根誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。

生根率=(生根幼芽個(gè)數(shù)/接種幼芽總數(shù))×100%。

煉苗移栽：將煉苗3～5 d后的組培苗，移栽到消毒處理過(guò)的泥炭土和細(xì)沙混合的基質(zhì)中(V(泥炭土)∶V(細(xì)沙)=1∶1)，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 96-II喜樹(shù)葉片愈傷組織及芽誘導(dǎo)

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

應(yīng)用WPM、MS和B53種基本培養(yǎng)基，并用6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L激素組合進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織效果比較，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。研究表明，葉片培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)受到抑制，不能利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，逐漸死亡。MS培養(yǎng)基中鹽質(zhì)量濃度高，96-II喜樹(shù)的葉片不能吸收利用，反而被毒害致死。即使能夠存活，葉片也干枯，生長(zhǎng)明顯受到抑制。WPM培養(yǎng)基上葉片愈傷組織誘導(dǎo)率(97.6%)明顯高于在B5培養(yǎng)基(56.9%)。愈傷組織體積大，結(jié)構(gòu)致密，分化率高。由此，確定WPM為誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳基本培養(yǎng)基。

表1 3種培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的效果

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果

2.1.2 不同激素組合對(duì)96-II喜樹(shù)葉片愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

從表2可以看出，只有細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素同時(shí)使用時(shí)，葉片才能被誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織，但只有二者達(dá)到適合比例時(shí)所形成的愈傷組織才具有再分化出不定芽的能力。單獨(dú)施加6-BA時(shí)對(duì)96-II喜樹(shù)葉片誘導(dǎo)愈傷組織不起作用，只有同時(shí)加入生長(zhǎng)素后才能誘導(dǎo)形成愈傷組織。加入NAA、2，4-D都能很好誘導(dǎo)形成愈傷組織，但2，4-D與6-BA組合時(shí)，無(wú)論2，4-D質(zhì)量濃度高低，愈傷組織誘導(dǎo)率都很高，長(zhǎng)勢(shì)快，但所形成的愈傷組織為白色，質(zhì)地疏松，20 d后所形成的愈傷組織完全覆蓋了整個(gè)葉片，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織表面會(huì)由白色轉(zhuǎn)為紅色，所形成的愈傷組織都不能分化出芽(圖2)。說(shuō)明2，4-D作用較強(qiáng)，使愈傷組織一直保持脫分化狀態(tài)，很能轉(zhuǎn)入分化狀態(tài)。

當(dāng)NAA與6-BA組合時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率與二者的質(zhì)量濃度都相關(guān)，且所形成的愈傷組織，綠色，結(jié)構(gòu)致密，幾乎都能分化出芽。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度不變時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著NAA質(zhì)量濃度升高而升高，愈傷組織的大小與NAA質(zhì)量濃度也成正比。但是6-BA的質(zhì)量濃度不與愈傷組織的體積成正比，6-BA為1.0 mg/L時(shí)愈傷組織形成明顯好于6-BA0.5 mg/L時(shí)，但是當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織形成受到了抑制，形成較晚，且體積小。這是因?yàn)檫@種生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的配比，不適合96-II喜樹(shù)葉片誘導(dǎo)愈傷組織。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí)，所誘導(dǎo)的愈傷組織形成早，長(zhǎng)勢(shì)好，體積大，所以認(rèn)為6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L 的組合好于其它組合。

當(dāng)6-BA、NAA和2，4-D3種激素同時(shí)使用時(shí)，愈傷組織形成明顯快于其它激素的組合。但是當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度增高時(shí)愈傷組織呈現(xiàn)白色，分化率降低。當(dāng)2，4-D質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織快，體積大，芽分化率很高。所以認(rèn)為誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最好的激素組合為6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2，4-D0.1 mg/L。

表2 不同激素組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)和分化效果的影響

圖2 不同的激素組合誘導(dǎo)的96-II喜樹(shù)葉片的愈傷組織

2.1.3 激素6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響

在研究中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在含有細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高而生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度過(guò)低的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化，會(huì)形成過(guò)于細(xì)密的嫩芽，雖然提高了增值速度，但苗多而弱，降低了芽的質(zhì)量，不適宜作為生根或移栽用苗，甚至還會(huì)出現(xiàn)抑制分化的情況。只有轉(zhuǎn)入沒(méi)有生長(zhǎng)素，低水平的細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上，才能分化，抽枝、展葉，形成叢生芽。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同質(zhì)量濃度6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織分化的情況見(jiàn)表3。當(dāng)6-BA為0.2 mg/L時(shí)，苗健壯，但是分化率低;當(dāng)6-BA0.8 mg/L時(shí)愈傷組織分化率高，但是芽的狀態(tài)弱小，不利于生根等其他用途;在6-BA1.0 mg/L時(shí)愈傷組織分化受到抑制，分化率低且芽弱小;當(dāng)6-BA0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織分化率高，且苗健壯。所以，確定6-BA為0.5 mg/L是誘導(dǎo)96-II喜樹(shù)愈傷組織分化最適合的激素質(zhì)量濃度。

表3 不同6-BA質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織分化及不定枝增值的影響

圖3 愈傷組織分化的再生苗

2.2 96-II喜樹(shù)根誘導(dǎo)

生長(zhǎng)素對(duì)不定根的形成起關(guān)鍵性作用。在無(wú)激素的條件下，再生苗也能生根，但是生根率很低，只有33.3%，而且根的平均數(shù)量為2條。加入生長(zhǎng)素后，生根狀況都有了改善。IBA和NAA在高質(zhì)量濃度時(shí)都能很好的誘導(dǎo)生根，從表4可以看出生根率和平均生根數(shù)都分別隨兩種激素質(zhì)量濃度的增加而增長(zhǎng)。而且生根的質(zhì)量也和兩種激素的質(zhì)量濃度成正比。但從圖4中可以看出二者的生根效果不同，IBA誘導(dǎo)的根細(xì)長(zhǎng)，均勻;NAA誘導(dǎo)的根粗壯，但生根較晚。IBA誘導(dǎo)生根的苗，在其基部直接生出根，莖中的維管組織與根中的維管組織直接相連，移栽后容易成活;NAA誘導(dǎo)生根的苗開(kāi)始在莖的基部形成愈傷組織，然后在所形成的愈傷組織上生出粗壯的根。隨著NAA質(zhì)量濃度的增高所形成的愈傷組織也增大，且根形成變晚。說(shuō)明NAA先誘導(dǎo)莖基部脫分化，然后誘導(dǎo)愈傷組織分化生成根，這樣形成的根與莖之間并無(wú)維管組織的直接聯(lián)系，以致移栽后不能成活。從圖4看出，試管苗在IBA的誘導(dǎo)下植株生長(zhǎng)正常，而在NAA的誘導(dǎo)下植株不生長(zhǎng)，且葉片下垂。隨著NAA的質(zhì)量濃度的增加，這種現(xiàn)象越明顯，說(shuō)明NAA抑制了植株的生長(zhǎng)。由此，可以確定最佳的生根的激素為IBA，質(zhì)量濃度為0.8 mg/L。

表4 不同的激素種類(lèi)及質(zhì)量濃度對(duì)生根的影響

圖4 不同激素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

2.3 96-II喜樹(shù)煉苗和移栽

將組培苗根長(zhǎng)為1～2 cm時(shí)，去掉封口膜，在陽(yáng)光充足的溫室內(nèi)，煉苗3～5 d，用自來(lái)水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒處理的混合的基質(zhì)中(V(泥炭土)∶V(細(xì)沙)=1∶1)，在培養(yǎng)期間使用塑料膜小拱棚保溫、保濕。30 d后調(diào)查，96-II喜樹(shù)組培苗成活率為95%以上(圖5、6)。

圖5 生根的96-II喜樹(shù)再生苗

圖6 移栽的96-II喜樹(shù)組培苗

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)96-II喜樹(shù)無(wú)菌苗葉片離體培養(yǎng)，研究了不同基本培養(yǎng)基和不同質(zhì)量濃度的激素配合使用對(duì)96-II喜樹(shù)葉片愈傷組織誘導(dǎo)途徑再生的條件。結(jié)果表明96-II喜樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)需要生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素配合使用，單獨(dú)使用6-BA不能誘導(dǎo)愈傷組織。2，4-D與6-BA配合對(duì)于誘導(dǎo)愈傷組織作用明顯，愈傷組織形成早，速度快，但所誘導(dǎo)的愈傷組織不具有分化能力。NAA與6-BA配合，隨著NAA質(zhì)量濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高，且具有很高的分化潛力，但愈傷組織形成速度稍慢，所以配合低質(zhì)量濃度的2，4-D能提高愈傷組織誘導(dǎo)速率，但2，4-D質(zhì)量濃度過(guò)高，影響愈傷組織分化。所以篩選3種激素之間的質(zhì)量濃度比例是很重要的。組培苗移栽前，必須經(jīng)過(guò)外界環(huán)境馴化或鍛煉，才能適應(yīng)外界的溫度、濕度和強(qiáng)烈的自然光照。所以在移栽前要先去掉封口膜，在陽(yáng)光充足的溫室內(nèi)，鍛煉小苗3～5 d，有利于提高組培苗移栽成活率。其間可適當(dāng)增加光照強(qiáng)度，以提高小苗的木質(zhì)化程度。

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