雙歧桿菌脂磷壁酸對胃癌SGC7901細胞SphK1表達的影響

劉 寧，魯志剛

（1.乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；3.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱 150086）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人體腸道內最主要的生理性有益菌，與人體的許多病理、生理現象密切相關。雙歧桿菌在體內發(fā)揮著許多重要的生理功能，如生物屏障、抗衰老、改善乳糖消化不良和營養(yǎng)免疫等，其中抗腫瘤作用是最受關注的功能之中。雙歧桿菌活體、滅活菌體、完整的細胞壁肽多糖、胞外多糖及細菌素等均有較高的抗腫瘤活性。脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）是普遍存在于革蘭氏陽性菌細胞壁中的一種成分。目前國內對雙歧桿菌研究的較多，主要集中在免疫激活、抗突變、抗衰老、粘附及腫瘤等方面[1]。

鞘磷脂（Sphingolipid）是所有真核生物的細胞膜中普遍存在的組分。在鞘磷脂類物質的代謝中，神經酰胺（Ceramide，Cer）是一種細胞凋亡的誘導分子，細胞內Cer水平升高能直接導致細胞凋亡；而其下游代謝產物1-磷酸鞘氨醇（S1P）則可以通過多種途徑抑制凋亡、促進存活，它們之間相對平衡決定細胞增殖或死亡。鞘氨醇激酶 1（Sphingosine kinase 1，SphK1）是這種動態(tài)平衡的關鍵調節(jié)者，同時其自身也是一種癌基因[2]。

本研究從鞘磷脂信號通路出發(fā)，應用RTPCR和Western blot探討雙歧桿菌LTA對胃癌SGC7901細胞內SphK1表達是否具有抑制作用，為闡明脂磷壁酸抑制胃癌的機理作進一步的探討，同時也為發(fā)現腫瘤治療的有效靶標提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雙歧桿菌LTA的制備參考樂軍等的方法[3]，用非離子型去垢劑Triton X-114提取，通過DEAESephacel陰離子交換色譜純化；胃癌SGC7901細胞株（購自哈爾濱醫(yī)科大學）；Trizol（購自Invitrogen公司）；RT-PCR反轉錄試劑盒（購自北京天根公司）；SphK1和GAPDH引物序列由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成；兔源SphK1抗體（一抗）（購自Cell Signaling Technology）；辣根過氧化物酶標記的IgG（二抗）（來自于北京中杉金橋公司）；ECL發(fā)光檢測試劑盒（購自南京凱基生物）；RPMI 1640（購自Invitrogen公司）；胎牛血清購自杭州四季青。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR檢測SphK1 mRNA表達

引物用Primer5設計完成，序列如下：SphK1 Forward∶5'TGGATGGTCAGCGGTTGC 3'，Reverse∶5'CTGGGAATGTCACTTTATTTGGAT 3'，擴增片斷為348 bp；GAPDH Forward∶5'TCCCATCACCATCTTC CAG 3'， Reverse∶5'ATGAGTCCTTCCACGATACC 3'，擴增片斷為309 bp。

細胞經0、200、500 μg·mL-1LTA處理72 h后收集細胞并加入1 mL Trizol進行總RNA的提取，用分光光度計根據OD260和OD280進行RNA濃度的測定。隨后根據逆轉錄試劑盒進行cDNA的合成，反應體系為20 μL，包括：2 μL 10 × RT Mix，2 μL超純dNTP，2 μL Oligo-dT15，1 μL逆轉錄酶，3 μL Rnase-free水，10 μL模板RNA。PCR反應體系為12.5 μL Master Mix，上下游引物各1 μL，cDNA模板5 μL，補充ddH2O至25 μL。擴增條件為：95℃5 min;95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取 PCR 產物 5 μL 與 1 μL 6×Loading Buffer混合上樣于1%瓊脂糖凝膠，100 mA，電泳40 min后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果并成像。灰度分析使用Image J軟件。

1.2.2 Western blot檢測SphK1蛋白表達

細胞經 0，200，500 μg·mL-1LTA 處理 72 h后，用預冷的PBS洗兩次，用細胞裂解液提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，調整蛋白量為20～25與5×SDS上樣緩沖液以4∶1的比例混勻，煮沸變性5 min。12 000 g離心取上清于10%SDS-PAGE進行蛋白分離。電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V。隨后將蛋白轉印至硝酸纖維素（NC）膜上，用含5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。按說明書比例稀釋一抗，將膜在4℃雜交過夜，然后用TBST洗去多余未結合的抗體，室溫洗滌3次，每次15 min。隨后用二抗室溫搖動1～2 h進行結合，用TBST洗膜3次去掉多余抗體，每次15 min。最后用增強型化學發(fā)光劑（ECL）于暗室中進行曝光及顯影定影，將膠片掃描成像，進行灰度分析。以α-tubulin作為內參進行檢測。

細胞裂解液的組分為：20 mmol·L-1Tris，pH 7.4；20%甘油；1 mmol·L-1β-巰基乙醇；1 mmol·L-1EDTA；5 mmol·L-1原釩酸鈉；15 mmol·L-1NaF；40 mmol·L-1β-甘油磷酸；10 μg·mL-1亮肽素和抑肽酶；1 mol·L-1PMSF（臨用前補加）。

1.2.3 統(tǒng)計學分析

每個試驗均重復3次，結果用均值±標準差（Mean±SD）形式表示。與對照組的比較采用非配對t檢驗，以P＜0.05為差異顯著。統(tǒng)計分析及作圖使用OriginPro 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌LTA對SGC7901細胞內SphK1基因表達的影響

圖1是分別用 0，200，500 μg·mL-1處理72 h后SGC7901細胞內SphK1基因和GAPDH表達的結果。利用Image J進行灰度分析，SphK1條帶灰度值除以GAPDH條帶灰度值為SphK1相對表達量（Relative Expression，R.E.），結果如下：

對照：1.23±0.04；200 μg·mL-1LTA處理：0.54±0.01；500 μg·mL-1LTA 處理：0.20±0.02。結果表明LTA對SGC7901胃癌細胞內SphK1基因有明顯的抑制作用（P＜0.01），高濃度LTA抑制作用更大（見圖1、2）。

圖1 RT-PCR檢測LTA處理72 h后SphK1基因表達Fig.1 SphK1 gene expression by RT-PCR after treatment with LTA for 72 h

圖2 LTA處理72 h后SphK1基因相對表達量Fig.2 Relative expression of SphK1 gene after treatment with LTA for 72 h

2.2 雙歧桿菌LTA對SGC7901細胞內SphK1蛋白表達的影響

LTA處理72 h后用Western Blot檢測SGC7901細胞內SphK1蛋白如圖3所示，經灰度分析結果如下：對照組為0.91±0.03，200 μg·mL-1LTA處理組為0.82±0.04，500 μg·mL-1LTA處理組為0.49±0.02（見圖3、4）。

圖3 LTA處理72 h后的SphK1蛋白表達Fig.3 SphK1 protein expressions after treatment with LTA for 72 h

圖4 LTA處理72 h后SphK1蛋白相對表達量Fig.4 Relative expression of SphK1 protein after treatment with LTA for 72 h

3 討論

雙歧桿菌的表面分子LTA對多種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞都具有直接的生長抑制作用，并能誘導腫瘤細胞凋亡和分化，國內對其作用機制研究較多。研究顯示LTA對胃癌SGC7901細胞的增殖有抑制作用，并隨著其濃度升高而增強；利用TUNEL法觀察LTA處理后的細胞，出現了凋亡現象（數據未顯示）。由于鞘磷脂信號在細胞凋亡中的作用逐漸被研究證實，LTA誘導SGC7901細胞調亡通過抑制這一通路實現。

鞘磷脂代謝物在介導癌細胞存活、死亡和分化的信號途徑中起關鍵作用。Cer和S1P之間比例形成的“鞘磷脂變阻器”決定了一個細胞是死亡還是存活。SphK1是最重要并直接調節(jié)這些鞘磷脂信使的介導者[4]，同時其自身也是一種癌基因。研究發(fā)現SphK1 mRNA在許多腫瘤組織和細胞中都有高表達[5]，使得它成為一種公認的治療癌癥的鞘標。最新的研究表明SphK1表達的高低與胃癌的發(fā)展和較低的患者存活率相關[6]，因此抑制SphK1表達是發(fā)揮抗腫瘤作用的機制所在，也是進行新型藥物開發(fā)的有力支持。目前一些具有藥理活性的復合物已經被發(fā)現或分離出來，其中一些來源于微生物[7-8]，還有一些是合成的鞘磷脂類似物[2,9]。

本研究利用不同濃度LTA處理胃癌SGC7901細胞后檢測其SphK1基因和蛋白表達情況。結果顯示200、500 μg·mL-1的LTA對SphK1的基因和蛋白表達均具有明顯的抑制作用，且500 μg·mL-1LTA抑制作用更強。研究結果表明，雙歧桿菌LTA能夠抑制胃癌SGC7901細胞內SphK1基因和蛋白表達，且濃度越高抑制作用越強。抑制的結果是一方面可以有效地抑制促存活的S1P的生成，增加促凋亡的Cer的生成；另一方面，由于SphK1自身也是一種癌基因，抑制其表達能夠從根本上抑制這一信號通路，最終的結果是促使細胞走向凋亡。研究結果印證并初步解釋了雙歧桿菌LTA抑制SGC7901細胞增殖及誘導凋亡的作用。本研究在一定程度上證明LTA作為一種天然產物有希望成為癌癥治療物質，更重要的是為SphK1信號通路作為治療癌癥的靶標提供有力支持。對于LTA抑制SphK1同時是否影響其他信號通路，還需進一步研究。

[1]劉春梅,魏華,郭亮,等.雙歧桿菌脂磷壁酸生物學活性研究進展[J].天然產物研究與開發(fā),2007,19∶905-909,916.

[2]Bektas M,Johnson S P,Poe W E,et al.A sphingosine kinase inhibitor induces cell death in temozolomide resistant glioblastoma cells[J].Cancer Chemoth Pharmacol,2009,64(5)∶1053-1058.

[3]樂軍,胡宏.非離子型去垢劑TritonX-114提取兩歧雙歧桿菌的脂磷壁酸[J].中國微生態(tài)學雜志,1997,9(4)∶5-8.

[4]Maceyka M,Payne S G,Milstien S,et al.Sphingosine kinase,sphingosine-1-phosphate,and apoptosis[J].Biochim Biophys Acta,2002,(2-3)∶193-201.

[5]French K J,Schrecengost R S,Lee B D,et al.Discovery and evaluation of inhibitors of human sphingosine kinase[J].Cancer Res,2003,63(18)∶5962-5969.

[6]Li W,Yu C P,Xia J T,et al.Sphingosine kinase 1 is associated with gastric cancer progression and poor survival of patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(4)∶1393-1399.

[7]Kono K,Sugiura M,Kohama T.Inhibition of recombinant sphingosine kinases by novel inhibitors of microbial origin,F-12509A and B-5354c[J].J Antibiot(Tokyo),2002,55(1)∶99-103.

[8]Kono K,Tanaka M,Mizuno T,et al.B-535a,b and c,new sphingosine kinase inhibitors,produced by a marine bacterium;taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical properties and structure determination[J].J Antibiot(Tokyo),2000,53(8)∶753-758.

[9]Kim J,Kim Y,Inagaki Y,et al.Synthesis and evaluation of sphingoid analogs as inhibitors of sphingosine kinases[J].Bioorg Med Chem,2005,13(10)∶3475-3485.