不同形態(tài)氮素對大豆硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白質(zhì)含量的影響

胡潤芳，張廣慶，滕振勇，林國強

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州 350013；2.福建省種子總站，福州 350003）

大豆籽粒蛋白質(zhì)含量與氮代謝密切相關(guān)，許多研究表明硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是氮素同化的關(guān)鍵酶[1-2]。已有研究報道追施氮素能提高植物葉片NR和GS活性，并對籽粒蛋白質(zhì)含量有促進作用；不同氮源對大豆葉片NR和GS活性的影響結(jié)論不一；陳煜等認(rèn)為NO3--N增加大豆葉片NR活性效果最好而增加GS活性效果差，混合態(tài)氮和NH4+-N增加大豆葉片GS活性效果好[3-7]。而在蛋白質(zhì)含量不同的大豆品種中施用不同形態(tài)的氮素對這兩種酶的活性及籽粒蛋白質(zhì)含量有何影響少見報道。

本研究選用蛋白質(zhì)含量差異較大而生育期和產(chǎn)量水平相近、當(dāng)前在福建省大面積推廣種植的3個國審春大豆品種進行氮素試驗，旨在進一步探明不同形態(tài)的氮素對大豆NR和GS活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響，以期為大豆優(yōu)質(zhì)育種和科學(xué)栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

泉豆7號（蛋白質(zhì)含量41.83%）、福豆310（蛋白質(zhì)含量46.04%）、福豆234（蛋白質(zhì)含量48.93%）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2010年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所試驗地進行。土壤基礎(chǔ)肥力：有機質(zhì)1.00%，全氮0.092%，全磷0.042%，速效磷39.8 mg·kg-1，速效鉀192.2 mg·kg-1。選用銨態(tài)氮（（NH4）2SO4）、混合態(tài)氮（NH4NO3）和硝態(tài)氮（KNO3）溶液（氮素濃度均為100 mmol·L-1），在晴天對花莢期植株每穴2株1次性1 L進行灌根處理，以清水為對照，隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，畦長7.4 m，畦寬0.9 m，雙行種植。每小區(qū)選生長基本一致的5株掛牌標(biāo)記，誘導(dǎo)48 h，每株各取一片剛完全展開功能葉（倒2、3葉）混合并立即用冰盒帶回實驗室進行NR和GS活性測定；成熟期收獲掛牌5株籽粒，測定籽粒蛋白質(zhì)含量。

1.3 NR活性的測定

采用活體法[8]。將大豆葉片洗凈吸干，用打孔器打成0.5～1 cm的圓片，迅速稱取0.5 g樣品4份分別置于50 mL三角瓶里，其中1份為對照，3份用于活性測定。對照先加入1 mL 30%的三氯乙酸，然后每瓶中加4 mL 0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.5）和 5 mL 0.2 mol·L-1KNO3溶液，將三角瓶反復(fù)抽真空，使葉片沉于瓶底。30℃暗培養(yǎng)30 min，取出后立即向活性測試瓶中加入1 mL 30%的三氯乙酸并搖勻，終止酶反應(yīng)。3 000 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL于試管中，加4 mL 1%磺胺和0.2%α-萘胺。搖勻在30℃水浴中保溫20 min。然后在520 nm波長下比色測定消光值。

1.4 GS活性的測定

利用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行。將大豆葉片洗凈吸干，用打孔器打成0.5～1 cm的圓片，準(zhǔn)確稱取，按體積比加4倍生理鹽水（0.5 g葉片+2 mL生理鹽水），制成20%勻漿，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液稀釋成10%的勻漿進行GS測定[9]。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測定

凱氏定氮法測定[10]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用唐啟義的DPS分析軟件進行分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能葉片硝酸還原酶（NR）活性的變化

不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)處理3個大豆品種的NR活性變化見表1。方差分析結(jié)果表明：處理間差異極顯著（F=5.41**），（NH4）2SO4處理3個大豆品種的功能葉片NR活性最高，并隨大豆品種蛋白質(zhì)含量升高有明顯的下降趨勢，其次是NH4NO3處理，KNO3處理效果較差，對NR活性幾乎沒影響。經(jīng)NH4+-N和混合態(tài)氮誘導(dǎo)處理后：泉豆7號功能葉片NR活性分別高于對照水處理101.07%和30.45%，差異極顯著（P＜0.01）；福豆310功能葉片NR活性分別高于對照水處理42.40%和12.47%，差異顯著（P＜0.05）；而福豆234其功能葉片NR活性分別高于對照水處理11.96%和11.65%，差異不顯著?？梢钥闯?，NH4+-N和混合態(tài)氮誘導(dǎo)處理對蛋白質(zhì)含量低的大豆品種效果更佳。在3個品種間，對照水處理NR活性福豆234比泉豆7號高46.61%，差異極顯著（P＜0.01）；比福豆 310高 13.18%，差異顯著（P＜0.05）；福豆310則比泉豆7號高29.54%，差異顯著（P＜0.05）。由此可見，高蛋白大豆品種功能葉片中的NR活性高于低蛋白大豆品種。

2.2 功能葉片谷氨酰胺合成酶（GS）活性的變化

不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)處理3個大豆品種的功能葉片GS活性變化見表2。三種形態(tài)的氮素均能明顯提高3個大豆品種功能葉片GS活性，處理間差異極顯著（F=6.49**），對不同品種誘導(dǎo)效果有差異。泉豆7號功能葉片的GS活性是（NH4）2SO4＞KNO3＞NH4NO3＞水，GS活性分別高于對照水處理99.52%、84.07%、64.49%，與對照比差異極顯著（P＜0.01），三種形態(tài)氮素間差異不顯著；福豆310其功能葉片的GS活性是NH4NO3處理最高，與對照比差異極顯著（P＜0.01），（NH4）2SO4和KNO3處理達(dá)顯著水平（P＜0.05），GS活性分別高于對照水處理40.65%、37.10%、32.51%，三種形態(tài)氮素間差異不顯著。從表2可以看出，（NH4）2SO4處理GS活性隨大豆品種蛋白質(zhì)含量降低而增強，NH4NO3處理GS活性隨大豆品種蛋白質(zhì)含量升高而增強；高蛋白大豆品種功能葉片中的GS活性也高于低蛋白大豆品種。

表1 不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)大豆功能葉片的NR活性Table 1 NR activities of functional leaves of soybean genotypes induced with different nitrogens

表2 不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)大豆功能葉片的GS活性Table 2 GS activities of functional leaves of soybean genotypes induced with different nitrogens

2.3 籽粒蛋白質(zhì)含量的變化

在三種形態(tài)氮素誘導(dǎo)下，3個大豆品種的籽粒蛋白質(zhì)含量均有不同程度的增加（見表3），品種間差異極顯著（F=42.99**），處理間差異顯著（F=4.20*）。泉豆7號籽粒蛋白質(zhì)含量增加最多，分別比對照水處理增加7.23%、6.68%和6.60%，均達(dá)到極顯著水平；其次是福豆310，（NH4）2SO4和NH4NO3處理，籽粒蛋白質(zhì)含量分別比對照水處理增加5.64%和6.04%，差異極顯著；福豆234籽粒蛋白質(zhì)含量增加最少，均不顯著。以3次重復(fù)平均值為基本單位的相關(guān)分析表明，NR和GS活性與籽粒蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)（r=0.520*和0.550*）。3個大豆品種功能葉片NR活性與其籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)性有差異，泉豆7號呈顯著正相關(guān)，福豆310呈極顯著正相關(guān)，而福豆234呈低度正相關(guān)；3個大豆品種功能葉片GS活性與籽粒蛋白質(zhì)含量均呈極顯著正相關(guān)；對照水處理的NR和GS活性與對應(yīng)的籽粒蛋白質(zhì)含量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.998**和r=0.861**。

表3 不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)大豆籽粒的蛋白質(zhì)含量Table 3 Seed protein content of soybean genotypes induced with different nitrogens

3 討論與結(jié)論

在本研究中，不同形態(tài)氮素誘導(dǎo)處理3個大豆品種的籽粒蛋白質(zhì)含量與功能葉片NR和GS活性呈顯著正相關(guān)，大豆花莢期高蛋白品種功能葉片中的NR和GS活性均高于低蛋白大豆品種，且對照水處理的NR和GS活性與對應(yīng)的籽粒蛋白質(zhì)含量均呈極顯著正相關(guān)。這與前人的研究有相同之處：李豪喆認(rèn)為不同品種間葉片中的NR活性有顯著差異，其差異與不同品種籽粒蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)[12]；張磊等也指出高蛋白品種葉片NR活性高，低蛋白品種葉片NR活性低[5]；陳煜等研究認(rèn)為，大豆籽粒蛋白質(zhì)含量與葉片NR活性呈極顯著正相關(guān)[6]；而GS活性與蛋白質(zhì)合成也密切相關(guān)，GS活性越高越有利于蛋白質(zhì)合成[8]。因此，可以把大豆花莢期葉片NR和GS的活性作為高蛋白品種選育的參考指標(biāo)之一。

不同形態(tài)的氮素對植物體內(nèi)的NR活性有不同的影響。趙越等認(rèn)為NH4+-N抑制甜菜NR的活性[13]；陳煜等認(rèn)為NO3--N增加大豆葉片NR活性效果最好[6]；王小純等認(rèn)為不同小麥品種NR對氮素形態(tài)的反應(yīng)不同，NH4+-N對增加弱筋小麥豫麥50和中筋小麥豫麥49 NR活性較強[14]。而在本研究中NH4+-N增加大豆葉片NR活性效果最好，其次是混合態(tài)氮，NO3--N效果較差；是否是KNO3處理中含有的K+再加上土壤中一定量的K+，使K+濃度過高影響到葉片中NR的活性[15]，有待進一步研究，或可能是供試品種NR對NH4+-N反應(yīng)較敏感。NH4+-N和混合態(tài)氮誘導(dǎo)處理尤其對低蛋白大豆品種效果更佳，這可能是因為低蛋白大豆品種葉片NR活性低，對氮素誘導(dǎo)更加敏感。

GS是NH4+進一步形成氨基酸反應(yīng)過程中的關(guān)鍵酶[16]。研究認(rèn)為NH4+-N對高等植物及蕨類的GS活性有促進作用[16-17]；張宏紀(jì)等認(rèn)為銨態(tài)氮對增加甜菜GS活性效果好于硝態(tài)氮[18]。印莉萍等認(rèn)為NH4+處理的小麥葉部GS活性比NO3-處理的高[19]；陳煜等認(rèn)為混合態(tài)氮和NH4+-N的處理大豆葉片的GS活性比NO3--N處理的高[6]。本研究結(jié)果與前人不盡相同，三種形態(tài)的氮素均能明顯提高3個大豆品種功能葉片GS活性，但對不同品種誘導(dǎo)效果有差異，NH4+-N增加低蛋白大豆品種GS活性效果較好，混合態(tài)氮增加高蛋白大豆品種GS活性效果較好；三種形態(tài)的氮素對增加低蛋白大豆品種GS活性效果更佳，這也可能是因為低蛋白大豆品種葉片GS活性低，對氮素尤其是對NH4+誘導(dǎo)更加敏感。

經(jīng)三種形態(tài)的氮素誘導(dǎo)處理后，3個大豆品種功能葉片NR和GS活性均有不同程度提高，對籽粒蛋白質(zhì)含量有促進作用。前人也已研究增施適量氮肥能提高大豆蛋白質(zhì)含量[20]。在生產(chǎn)上可根據(jù)不同大豆品種田間生長情況在花莢期酌情追施適量氮肥以提高功能葉片NR和GS活性從而提高籽粒品質(zhì)。綜合NR和GS活性變化，可考慮優(yōu)先選用NH4+-N和混合態(tài)氮。

氮素誘導(dǎo)處理尤其對提高低蛋白大豆品種的葉片NR和GS活性及籽粒蛋白質(zhì)含量效果更佳，這是否是因為高蛋白品種功能葉片中NR和GS活性本身處于高值，在生長過程中有利于氮素的吸收和利用，使植株內(nèi)氮素含量可能已經(jīng)處于較高水平，氮素對大豆NR和GS活性的促進作用是否具有飽和效應(yīng)尚有待進一步研究。

[1] 劉麗,甘志軍,王憲澤.植物氮代謝硝酸還原酶水平調(diào)控機制的研究進展[J].西北植物學(xué)報,2004,24(7):1355-1361．

[2] 李常健,林清華,張楚富．高等植物谷氨酰胺合成酶研究進展[J].生物學(xué)雜志,2001,18(4):1-3．

[3] 王月福,于振文,李尚霞,等．氮素營養(yǎng)水平對冬小麥代謝關(guān)鍵酶活性變化和籽粒蛋白質(zhì)含量的影響[J]．作物學(xué)報,2002,28(6):743-748．

[4] 柴小清,印莉萍,劉祥林,等．不同濃度的NO3-和NH4+對小麥根谷氨酰胺合成酶及其相關(guān)酶的影響[J]．植物學(xué)報,1996,38(10):803-808．

[5] 張磊,宋秋來,馬春梅,等．大豆葉片硝酸還原酶活性動態(tài)研究[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(6):73-76．

[6] 陳煜,朱保葛,張敬,等．不同氮源對大豆硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性及蛋白質(zhì)含量的影響[J].大豆科學(xué),2004,23(2):143-146．

[7]劉麗,鄒德堂．氮素用量對水稻籽粒谷氨酰胺合成酶活性及產(chǎn)量的影響[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(10):1-4．

[8] 張憲政．植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M]．沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,1994:77-82．

[9] 蔡柏巖,葛菁萍,祖?zhèn)ィ姿厮綄Σ煌蠖蛊贩N葉片及籽粒谷氨酰胺合成酶活性的影響[J]．植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2008,14(3):592-596．

[10] 魯如坤．土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M]．北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2000:308-312．

[11] 唐啟義,馮明光．實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]．北京:科學(xué)出版社,2002．

[12] 李豪喆．大豆葉片硝酸還原酶活力的研究[J]．植物生理學(xué)通訊,1986(4):30-32．

[13] 趙越,魏自民,馬鳳鳴．不同水平銨態(tài)氮對甜菜硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活力的影響[J]．中國糖料,2003(1):22-25．

[14] 王小純,熊淑萍,馬新明,等．不同形態(tài)氮素對專用型小麥花后氮代謝關(guān)鍵酶活性及籽粒蛋白質(zhì)含量的影響[J]．生態(tài)學(xué)報,2005,25(4):802-807.

[15] 焦峰,王鵬,翟瑞常．鉀肥對大豆硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2009,21(4):12-15．

[16] Peter J L,Miflin B J.Glutamate synthase and the synthesis of glutamate in plants[J].Plant Physiology and Biochemistry,2003,41(6-7):555-564.

[17] Marwaha R S,Juliano B O.Aspects of nitrogen metabolism in the rice seedling[J].Plant Physiology,1976,57(6):923-927.

[18] 張宏紀(jì),馬鳳鳴,李文華,等．不同形態(tài)氮素對甜菜谷氨酰胺合成酶活性的影響[J]．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2001(6):7-10．

[19] 印莉萍,劉祥林,柴小清,等．不同濃度不同氮源對小麥離體葉谷氨酰胺合成酶及其相關(guān)酶的影響[J]．首都師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1997(2):95-99．

[20] 管宇,劉麗君,董守坤,等．施氮對大豆植株氮素和蛋白質(zhì)含量的影響[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(7):1-4．