耐草甘膦大豆種質(zhì)資源篩選的研究

王 斌，張慶賀，陶 波，欒鳳俠,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，哈爾濱 150001）

草甘膦（Glyphosate）是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[1]，它能與PEP競爭性抑制合酶的活性，形成Epsps合酶-3-磷酸莽草酸（S3P）草甘磷的復(fù)合物，從而抑制了合成5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP合成酶）[2-4]，阻止了莽草酸途徑以及芳香族氨基酸的合成，擾亂了生物體正常的氮代謝而使其死亡。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，已具備了將對草甘膦不敏感的基因轉(zhuǎn)入作物中的能力。1996年，耐草甘膦大豆作為第一個轉(zhuǎn)基因作物以Roundup Ready品牌開始在美國市場投放，并且迅速在世界范圍內(nèi)推廣種植[5]。但隨著轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，其生態(tài)安全性問題也已受到國內(nèi)外的關(guān)注。1999年末，智力果園多花黑麥草（Lolium multiflorum）在草甘膦多年選擇的壓力下耐性有所提高；Bartsch等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)抗性基因可以通過花粉而漂移[6-8]，隨著有關(guān)抗性基因的飄移，以及對環(huán)境非靶標(biāo)生物的影響等研究不斷深入[9]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不足逐漸顯現(xiàn)出來。相比而言，常規(guī)育種手段雖然不能像轉(zhuǎn)基因技術(shù)一樣充分利用物種的基因資源，但是卻因為自身沒有外源基因的轉(zhuǎn)入而更容易被接受和推廣[10]。

非轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物的主要培育方法包括除草劑自然選擇與雜交法，化學(xué)誘變法和植物組織培養(yǎng)法[10]?？惯溥蜻愖魑锸悄壳巴ㄟ^非轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的主要作物，商品化的有玉米、油菜、水稻等[11-13]。陶波等自上世紀(jì)90年代開始，利用田間抗性篩選的方法對不同的菜豆品系進(jìn)行除草劑耐性資源的發(fā)掘，在66份菜豆種質(zhì)資源中成功篩選出了抗草甘膦的菜豆品系89-09、89-05-3[14]。

大豆是我國重要的糧食和油料作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及社會經(jīng)濟(jì)生活中都占有相當(dāng)重要的地位[15]，本研究通過田間篩選結(jié)合室內(nèi)盆栽試驗，對國內(nèi)上百份栽培大豆進(jìn)行了多年的篩選和鑒定，旨在篩選耐草甘膦作物的品種（系），為耐草甘膦新基因的發(fā)掘、耐性作物的理論研究及育種實踐提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆：褐皮豆等83份大豆品種由黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院提供；DS系列等24份大豆品系由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥教研室提供；東農(nóng)系列、合豐系列等6份大豆品種由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。

供試除草劑：農(nóng)達(dá)，41%草甘膦異丙胺鹽水劑，美國孟山都公司提供。

噴霧器：山東衛(wèi)士WS-16手動背負(fù)式噴霧器。

1.2 試驗設(shè)計

田間試驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗實習(xí)基地進(jìn)行，土壤為黑土。不同大豆品種的播種時間為2009年6月10日，收獲時間為2009年10月8日。播種方式為人工單粒點播，試驗區(qū)行長6 m，行距45 cm，株距10 cm。正常田間管理。植株生長至第一片三出復(fù)葉完全展開時進(jìn)行草甘膦噴灑處理，草甘膦濃度為田間推薦劑量1.24 kg·a.i.·hm-2，每個品種處理株數(shù)為200株。施藥后第14天觀察大豆死亡率，并觀察受害癥狀，描述并制定耐性等級。收獲時對耐性品系進(jìn)行考種分析，主要調(diào)查的農(nóng)藝性狀為成熟度、株高、主莖節(jié)數(shù)、分枝數(shù)、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株粒重。

室內(nèi)生物測定試驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗溫室進(jìn)行。將大豆種子消毒后，25℃溫水中浸泡6 h，27℃催芽12 h，備用。耐性試驗采用溫室盆栽法進(jìn)行。播種催芽后的種子，每盆4粒。草甘膦處理濃度梯度為0.38、0.49、0.61、0.74、0.98、1.24、1.55、1.86 kg·a.i.·hm-2，每濃度設(shè)置3次重復(fù)。計算抑制中濃度，以黑農(nóng)37的抑制中濃度為標(biāo)準(zhǔn)，求出抑制幾率方程，計算耐性倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

將死亡率轉(zhuǎn)換成機(jī)率值，藥劑濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)值，計算抑制率回歸方程（LD-p曲線），求抑制中濃度（LC50）；以相對耐藥性倍數(shù)表示耐性程度。所有數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大豆品種（系）對草甘膦的耐藥性鑒定

表1為對褐皮豆等89份栽培大豆品種進(jìn)行的田間草甘膦耐性特性的篩選。結(jié)果表明，栽培大豆品種對草甘膦耐性很差，但不同的大豆品種對草甘膦的耐性存在差異。在1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦劑量下，褐皮豆等22份品種有一定的耐性。其中褐皮豆和綏無腥豆1號耐性較好，存活率分別為19.5%和15%；另外20份品種耐性較差，存活率從11.5%～2%不等；而剩余67份品種則對草甘膦無耐性，存活率為0。

表2為對DS102號等24個經(jīng)過篩選的品系進(jìn)行草甘膦耐性程度檢測的田間試驗結(jié)果。結(jié)果表明，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的DS102等大豆品系對草甘膦的耐性有了顯著的提高。在1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦劑量下，DS102和DS204對草甘膦的耐性最強(qiáng)，與對照無明顯差異。其余DS系列品種的大豆對草甘膦也具有一定的耐性。

具有優(yōu)良性狀的作物種質(zhì)是開發(fā)作物新品種、進(jìn)行作物遺傳育種改良的重要資源。表1、2的研究結(jié)果表明，大豆種質(zhì)資源中對除草劑的耐性水平存在著極其大的變異范圍，不同的大豆品種（系）對草甘膦的耐性明顯不同。本研究為DS102等大豆品系耐草甘膦資源的研究提供了材料。

表1 1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦處理下21 d后各常規(guī)品種死亡率與耐性等級Table 1 Mortality and patience levels of conventional varieties 21 d after treated with 1.24 kg·a.i.·hm-2glyphosate

表2 1.24 kg·a.i.·hm-2草甘膦處理下21 d后各耐性品系死亡率與耐性等級Table 2 Mortality and patience levels of tolerant lines 21 d after treated with 1.24 kg·a.i.·hm-2glyphosate

2.2 DS耐性大豆品系（種）對草甘膦的耐性水平測定

通過溫室盆栽法進(jìn)一步研究了DS102等5個耐性品系對草甘膦的耐性水平。表3為草甘膦對不同耐性品系的抑制中濃度及耐性倍數(shù)。結(jié)果表明，隨著草甘膦濃度的增大，各個大豆品系的死亡率均呈上升趨勢，但耐性品系的死亡率明顯低于對照品種黑農(nóng)37。以黑農(nóng)37為對照，耐性品系的耐性倍數(shù)為4.23～2.48。對草甘膦的耐性程度為DS102 ＞DS204＞DS202＞DS301＞DS405＞黑農(nóng) 37。其中，DS102號的耐性倍數(shù)最高，為4.32，其LC50為1.67 kg·a.i.·hm-2。

表3 不同耐性大豆品系對不同濃度草甘膦處理的耐性水平鑒定Table 3 Tolerance level of different tolerance soybean treated with different concentrations of glyphosate

2.3 草甘膦對大豆生長期株高的影響

采用溫室盆栽法進(jìn)一步研究了草甘膦對耐性品系生長期株高的影響。由表4可知，由于草甘膦的藥效發(fā)揮較為緩慢，施藥后第1天，對照組與施藥組的株高差異均不明顯；第7天時黑農(nóng)37品種的對照組和施藥組的株高出現(xiàn)了顯著性差異（P＜0.05），說明草甘膦在第7天對黑農(nóng)37顯現(xiàn)出較明顯的抑制作用，而其余耐性品系雖然也有一定的抑制作用，但與對照相比，差異不顯著；在第14天和第21天的時候，各個品系的株高均與對照組產(chǎn)生顯著性差異，說明草甘膦在第14到第21天的時候藥效發(fā)揮最大，且各耐性品系在此時期受到一定的抑制生長的作用；在第30天，DS102和DS204的施藥組和對照組的株高無明顯差異，并且可以看出各耐性品種的株高均有恢復(fù)，說明耐性品種有較好的恢復(fù)能力。

2.4 草甘膦對耐性品系農(nóng)藝形狀的影響

收獲期對耐性品系的株高、百粒重、單株粒數(shù)、有效分枝等性狀進(jìn)行考種研究?？挤N結(jié)果表明，施用草甘膦后，大豆的各性狀指標(biāo)產(chǎn)生了較大的變異范圍。

由表5可知，耐性大豆的株高產(chǎn)生了較大的分化，其中DS102和DS202受到的抑制明顯輕于DS204、DS301和DS405；DS202的平均株高最高，為85.8 cm。施用草甘膦后，明顯增加了大豆品系的有效分枝數(shù)。其中，以DS102最為明顯，有效分枝數(shù)顯著高于對照，DS204、DS202、DS301有效分枝數(shù)略低于對照，DS405有效分枝數(shù)顯著低于對照；各品系主莖節(jié)數(shù)平均值與對照相比變化不大；各品系單株莢數(shù)、單株粒數(shù)和百粒重等產(chǎn)量指標(biāo)的變異范圍均較大，各指標(biāo)平均值均低于對照，其中DS204和DS405的單株莢數(shù)和單株粒數(shù)顯著低于對照。

表4 0.98 kg·a.i.·hm-2草甘膦對大豆生長期株高的影響Table 4 Height effect of soybean growth stage treated with 0.98 kg·a.i.·hm-2glyphosate

表5 耐性品系考種數(shù)據(jù)Table 5 Soybean tolerance test species data

各品系相比來說，DS405的株高和有效分枝的變異范圍較大，DS102的單株莢數(shù)、單株粒數(shù)和百粒重的變異范圍較大，其余品種介于兩者之間，說明DS405品系內(nèi)在外形上差異較大，而DS102的品系內(nèi)在產(chǎn)量上的差異較大。

3 討 論

轉(zhuǎn)基因植物自80年代初開始研究以來，近10余年植物基因工程研究進(jìn)展十分迅速[16]，在抗除草劑作物的培育中，鑒定并獲得具有天然耐藥性的植物是研究的關(guān)鍵，也是進(jìn)行其他生物技術(shù)以及遺傳工程修飾的前提。李萍等比較了34個谷子品種對除草劑撲草凈（Prometryn）和速收（Flumioxazin）的耐藥性差異，明確了除草劑壓力下各種生理生化指標(biāo)的變化[17]。作物不同品種或者是同種作物不同品系之間對除草劑的抗性水平具有很大的差別，是研究者選擇天然耐性植株的基礎(chǔ)，對于科學(xué)使用除草劑和抗除草劑品種的選育有重要的意義。

本研究表明，不同的大豆品系（種）對草甘膦的耐藥性存在著顯著性差異。DS102、204等品系表現(xiàn)了對草甘膦較高的耐性特性，且受害癥狀主要為心葉發(fā)黃，植株部分葉片萎蔫，但后期逐漸恢復(fù)，并且能夠正常結(jié)實，且通過溫室盆栽法進(jìn)一步驗證了耐性品系對草甘膦的耐性水平，得到結(jié)果為DS102＞DS204＞DS301＞DS202＞DS405，其耐性倍數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照品種黑農(nóng)37。

普通大豆品種經(jīng)除草劑處理后多表現(xiàn)為枯萎、不能成活或不結(jié)莢。本研究對耐性品系存活植株進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀的考種分析發(fā)現(xiàn)，部分植株雖然株高受到了草甘膦的抑制，但是仍能夠結(jié)莢。且經(jīng)過對主要的農(nóng)藝性狀的考種分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過草甘膦處理后耐性植株的有效分支數(shù)明顯多于對照，這也直接導(dǎo)致了部分耐性植株的單株產(chǎn)量高于對照。其原因可能是草甘膦處理后植株的生長點受到抑制或壞死，導(dǎo)致了耐性植株頂端優(yōu)勢喪失，分枝增多。

4 結(jié)論

本研究獲得了DS102等耐性大豆品系5份，并通過溫室盆栽法對其耐性水平進(jìn)行了測定，表明其耐性程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于常規(guī)栽培品種。田間農(nóng)藝形狀的測定除株高受抑制外，其單株粒數(shù)、有效分枝等性狀與未施藥對照無明顯差異。這些耐性品系的獲得以及豐富的農(nóng)藝形狀的正向變異為抗草甘膦大豆的育種提供了可能。

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