利用體外培養(yǎng)法測定精補料的營養(yǎng)價值

艷 城 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

通過飼料營養(yǎng)價值評定，可以了解和掌握各種動物對飼料養(yǎng)分的利用情況、需要量及其變化規(guī)律，為科學(xué)飼養(yǎng)奠定理論基礎(chǔ)。目前，評定飼料營養(yǎng)價值的方法主要有概略養(yǎng)分分析法、體內(nèi)法和體外法。概略養(yǎng)分分析法是評定飼料營養(yǎng)價值的一種常用方法，如總能、總磷、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等的測定方法。但利用此法所得的飼料養(yǎng)分與動物消化吸收的養(yǎng)分之間存在很大差異，不足以準(zhǔn)確地反映飼料的實際營養(yǎng)價值。體內(nèi)法是評定飼料在瘤胃內(nèi)降解率的直接方法。體內(nèi)法測定動物對飼料的采食量、消化率和利用率，并以此評估飼料的營養(yǎng)價值。然而，應(yīng)用傳統(tǒng)的體內(nèi)法來檢測飼料的消化率，實驗周期長、費用高，并且需要大量的樣品，不便于大規(guī)模進(jìn)行。另外，由于實驗動物個體間差異較大，實驗結(jié)果可重復(fù)性較差，不利于測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化。隨著動物消化生理研究的深入和技術(shù)手段的創(chuàng)新，利用動物體外消化模擬技術(shù)來研究飼料的營養(yǎng)價值已成為可能。因此人們建立了體外法來研究飼料的營養(yǎng)價值。體外法是借助生物學(xué)方法體外模擬動物消化過程估測飼料消化率。體外試驗技術(shù)因其操作方法較易掌握、實驗周期短、重復(fù)性好等特點得到了廣泛的應(yīng)用。在反芻動物飼料營養(yǎng)價值評定中采用的體外方法較典型的有：Tilley和Terry(1963)建立的兩步法 （兩級離體法）、體外產(chǎn)氣法（HFT技術(shù)）和體外連續(xù)培養(yǎng)法。

目前，應(yīng)用最廣泛的是Tilly和Terry（1963）提出的一步法和此后改進(jìn)的兩步法（即兩級離體法）。它是將瘤胃液過濾后與待測飼料在厭氧環(huán)境、適宜的溫度（38℃～39℃）和 pH（6.7～6.9）等條件下共同培養(yǎng)48h后，再用瘤胃蛋白酶（pH大約為2）培養(yǎng)48h，以模擬飼料在瘤胃、真胃和部分小腸的消化過程。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)管內(nèi)殘留物的分析結(jié)果，估測飼料消化率。測定飼料營養(yǎng)成分大多采用差值法。體外產(chǎn)氣法是Raab,L.等（1983）和德國荷恩海姆大學(xué)動物營養(yǎng)研究所Menke K.H等人建立的，是目前采用最多的用來評價飼料營養(yǎng)價值的方法之一。國外文獻(xiàn)多稱該方法為HFT技術(shù)。此方法是基于飼料樣品在體外用瘤胃液消化所產(chǎn)生氣體的比率來估計飼料消化率。飼料樣品的活體外經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體（C O2、CH4、H2）為微生物的代謝產(chǎn)物，因此，在一定的代謝途徑下，可以利用氣體產(chǎn)生的數(shù)量或速度反映營養(yǎng)物質(zhì)被瘤胃微生物發(fā)酵的程度和速度。消化率不同的各種飼料，在相應(yīng)的時間內(nèi)（一般為24h）產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣率不同。

本文針對利用兩步法和體外產(chǎn)氣法 （HFT技術(shù)）進(jìn)行飼料的營養(yǎng)價值評定做進(jìn)一步的概述，即采用瘤胃液對飼料進(jìn)行體外培養(yǎng)，以達(dá)到近似于瘤胃內(nèi)發(fā)酵環(huán)境來評定飼料的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

2011年3 月至2011年5月，內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)所。

1.2 試驗動物

營養(yǎng)所試驗基地的（具瘤胃瘺管的）絨山羊2只。

1.3 試驗材料

市售精補顆粒料，羊草由動物營養(yǎng)所試驗基地提供，試驗日糧為按表1配制的全混日糧。

瘤胃液采自裝有永久性瘤胃瘺管并飼喂精粗料比為40∶60飼糧的內(nèi)蒙古白絨山羊。

實驗試劑：緩沖液、胃蛋白酶溶液；培養(yǎng)液；0.2M鹽酸、工作液、A液、B液。

1.4 試驗方法

1.4.1 概略養(yǎng)分分析試驗方法

表1 全混日糧的配方

營養(yǎng)成分測定方法參照楊勝(1999)的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。

干物質(zhì)（DM）：用105℃干燥法測定。

粗脂肪（EE）：采用 SZF-06A脂肪測定儀，將烘干后的樣品用濾紙包裹后由玻璃入口放入，再加乙醚，使之反應(yīng)。4h后取出樣品烘干稱重，計算出脂肪含量。

粗灰分(Ash)：茂福爐中550℃～600℃下灰化測定。取烘干后的樣品移入坩鍋碳化、灰化(600℃)至恒重；測定每批樣品的粗灰分重量。

粗蛋白(CP)：用凱氏半微量定氮法測定。取烘干后的樣品移入消化管進(jìn)行消化，每份樣品中分別加入適量的催化劑和15m l的H2SO4后開始消化。消化完畢后，測定每批樣品的粗蛋白含量。

中性洗滌纖維(NDF)：取烘干后的樣品移入袋后按Van soest中性洗滌劑法測定。

非纖維性碳水化合物NFC%=100-(NDF%+CP%+Fat%+Ash%)

1.4.2 兩極離體試驗方法

首先在厭氧、39℃條件下,用瘤胃液的稀釋液消化1.5g底物樣品 （稱取樣品1.5g，放入培養(yǎng)瓶中，每管加入120m L的緩沖液混勻，通入CO2，直到其處于飽和狀態(tài)。放入培養(yǎng)箱中，使其溫度達(dá)到38℃，然后加入30m L瘤胃液，測定pH并通入CO2，，達(dá)到飽和。pH 應(yīng)保持在 6.7～6.9，利用 1mol/L的NaCO3來加以調(diào)整）放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,每天搖動2～3次。在培養(yǎng)開始后6小時和24小時測定pH值并進(jìn)行調(diào)整。然后加入1m L 5%HgCl2,2m L1moL/L的NaCO3以抑制微生物的活動，促進(jìn)沉淀，棄上清液。然后加入胃蛋白酶150m L在39℃、酸性條件（pH應(yīng)在1.5左右）下,消化48h。培養(yǎng)結(jié)束后,測定殘渣中的DM、CP和NDF含量,計算出DMD、CPD和NDFD含量。

1.4.3 體外產(chǎn)氣試驗方法

產(chǎn)氣量的測定：同時進(jìn)行3個重復(fù)的培養(yǎng),將0.4000g待測樣品干物質(zhì)置于特制的150m L酸奶瓶中,用60m L瘤胃稀釋液(20m l瘤胃液+40m l培養(yǎng)液)消化。 記錄 1、2、3、6、8、12、24、36、48 各時間點的產(chǎn)氣量。采用Groot等(1996)描述的多相組合模擬模型gas(ml)=a1/(1+(k1/t))c1+……+an/(1+(kn/t))cn計算動態(tài)消化產(chǎn)氣參數(shù)。式中：Y為a代表每一飼料組分理論上的最大產(chǎn)氣量(ml)；k為對應(yīng)飼料組分達(dá)到最大產(chǎn)氣量一半時所需時間 ,h；而c是決定曲線形狀的參數(shù)；t為培養(yǎng)時間(h)。從產(chǎn)氣開始后，按照時間點記錄產(chǎn)氣量，每次記錄完進(jìn)行放氣，使注射器的刻度為零，等下一次記錄完畢后又返回到零刻度。由于前幾個小時產(chǎn)氣較多，記錄時間稍微密集一點，以后間隔的時間稍長一點，以此減少試驗誤差。

活體外pH、NH3-N測定：在39℃、厭氧條件下,將0.2000g待測樣品干物質(zhì)置于特制的150m L酸奶瓶中,用30m L瘤胃稀釋液 (10m l瘤胃+20m l培養(yǎng)液)消化。每個培養(yǎng)設(shè)3個重復(fù)，待培養(yǎng)至24 h時立即測定發(fā)酵液pH（采用上海雷磁儀器廠產(chǎn)PHS-3B型高精度酸度計測定）,氨態(tài)氮含量測定參照馮宗慈等（1993）方法。

NH3-N測定方法為：依次量取工作液0、1、2、4、6m l置于5個編號的50m l容量瓶內(nèi)，接著依次加入蒸餾水 10、9、8、6、4m l， 使之成為 10m l。 再用0.2M鹽酸定容到刻度處，此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液每100m l的含氮量依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.2。 準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4m l分別置于5個10m l試管內(nèi)，各管內(nèi)依次加入A液2m l和B液2m l搖勻，靜置10分鐘后，用722分光光度計于波長700nm處比色，0.5cm的比色皿，用蒸餾水的0號試管作為空白對照，測定各溶液消光值(0號標(biāo)液保存，測樣品時調(diào)零點用)。用消光值作為自變量、溶液含N量作為從變量導(dǎo)出回歸方程式。做出標(biāo)線后，從培養(yǎng)液中取10m l于3500～4000r/m in下離心10m in，量取0.5m l上清液置于15m l試管內(nèi)，再加入9.5m l 0.2M鹽酸至10m l搖勻(稀釋倍數(shù)為20)，比色操作同上所述。把測得的消光值代入回歸公式，算得的結(jié)果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)即為原樣品中的氨氮含量。

1.5 試驗?zāi)康?/h3>

本試驗采用的日糧1為羔羊開口料，日糧2為羔羊育肥料。

在飼養(yǎng)羔羊的過程中，羔羊提前補飼可以促進(jìn)前胃的發(fā)育，增加羔羊營養(yǎng)來源，提高羔羊安全越冬能力，一般羔羊從10日齡開始到斷奶前都需進(jìn)行補飼。補飼前期用開口料飼喂槽羔羊。這個階段是羔羊由吃母乳逐漸到采食草料的過渡時期，從開始補飼到6周齡以母乳為主，補飼開口料為輔。6周齡到斷奶期間以補飼育肥料為主，母乳為輔，在補飼中逐漸增加優(yōu)質(zhì)干草與精補料的數(shù)量，減少母乳的飼喂量。

羔羊開口料和羔羊育肥料都要求具有全面的營養(yǎng)以及在消化道內(nèi)易消化降解，因此本試驗利用概略養(yǎng)分分析、兩級離體和體外產(chǎn)氣試驗等來綜合評價兩種日糧的營養(yǎng)價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 概略養(yǎng)分分析結(jié)果

表2 不同比例全混日糧營養(yǎng)成分

圖1 不同比例全混日糧營養(yǎng)成分

從圖1可以看出兩種不同比例全混日糧的營養(yǎng)成分，其中1號樣品中的三大營養(yǎng)物質(zhì)粗蛋白、粗脂肪和碳水化合物的含量較高。

2.2 兩級離體實驗結(jié)果

表2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

圖2 全混日糧DM消化率、CP消化率、NDF消化率

由上圖可以看出，不同比例全混日糧的消化率均為1號樣品的高。

2.3 體外產(chǎn)氣實驗結(jié)果

表3 不同比例全混日糧體外產(chǎn)氣量

圖3 不同比例全混日糧體外產(chǎn)氣量

由圖3可知，前3h兩個樣品的差距不大，3～24h內(nèi)1號樣品的產(chǎn)氣量明顯高于2號樣品的產(chǎn)氣量，而24h后產(chǎn)氣量極少。

表4 不同比例全混日糧產(chǎn)氣曲線

圖4 不同比例全混日糧產(chǎn)氣曲線

由圖4可以看出，兩種日糧最大產(chǎn)氣量分別為91.194（ml）、92.737（ml）。從不同發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系可以看出,在發(fā)酵時間比較短的情況下,理論最大產(chǎn)氣量受產(chǎn)氣速率及延滯時間的影響。而產(chǎn)氣速率與主要營養(yǎng)成分的含量之間存在著極顯著的相關(guān)性。

圖5 NH3-N標(biāo)線

由圖5可知，標(biāo)線y=1.094x-0.022（y：濃度，x：吸光度，原樣稀釋倍數(shù)為20倍）。

表5 NH3-N的濃度

由表5可以看出，1號樣品的氨氮濃度明顯高于2號樣品。

表6 pH值的測定

由表6可以看出，兩個樣品間pH值差距不大，和絨山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境相差不大，均處于正常生理范圍(pH值5.5～7.5)內(nèi),不會影響瘤胃的發(fā)酵功能。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

（1）不同精粗比日糧對消化率的影響

兩級離體技術(shù)測定的結(jié)果（表2）顯示，不同精粗比的飼料其消化率也不同，相對而言1號精補料的消化率比2號精補料的消化率高一些，差異不顯著。其粗蛋白的消化率最明顯，NDF在瘤胃的消化率是1號樣品高于2號樣品。這說明，消化率受粗蛋白質(zhì)的影響，飼料中粗蛋白含量越高其消化率越高。高含量的NDF會降低微生物對全混日糧的降解速率,從而延緩發(fā)酵的啟動。然而，當(dāng)日糧中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物或易發(fā)酵物質(zhì)的含量較高時,微生物會利用降解產(chǎn)物迅速繁殖,從而提高消化率。

（2）不同精粗比日糧對產(chǎn)氣量的影響

一般來說，產(chǎn)氣量是反映底物中碳水化合物組分被瘤胃微生物利用程度的標(biāo)志。體外產(chǎn)氣法發(fā)酵后的主要產(chǎn)物為CO2、CH4和VFA。然而,VFA在被緩沖劑中和后也會產(chǎn)生少量的氣體。因此,可以說產(chǎn)氣量反映了底物發(fā)酵。產(chǎn)氣量多，說明底物中碳水化合物組分含量高或被利用的比例大；產(chǎn)氣量少則反之。然而，在底物粗蛋白含量不同的條件下，瘤胃微生物產(chǎn)氣量的高低不能完全反映底物被利用的程度。Picard等曾報道，當(dāng)?shù)孜锏鞍踪|(zhì)含量高時，底物的DMD明顯提高，但底物的發(fā)酵產(chǎn)氣量明顯減少。

本試驗利用體外產(chǎn)氣法研究了2種不同全混日糧的營養(yǎng)價值。從圖中可以看出，前3h 1號日糧和2號日糧的產(chǎn)氣量差距不太明顯，而3～24h的產(chǎn)氣量1號日糧明顯高于2號日糧，24h以后2號日糧的產(chǎn)氣量比1號日糧的高?？偟膩碚f，1號日糧的產(chǎn)氣量均高于2號日糧。在瘤胃中，2種不同比例全混日糧發(fā)酵參數(shù)不同，可以說，在瘤胃中被消化吸收的程度不同。精飼料本身較易被動物的瘤胃液消化。不同比例全混日糧的最大產(chǎn)氣量為91.194、92.737。從不同發(fā)酵參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系可以看出,在發(fā)酵時間比較短的情況下,理論最大產(chǎn)氣量受產(chǎn)氣速率及延滯時間的影響。而產(chǎn)氣速率與主要營養(yǎng)成分的含量之間存在著極顯著的相關(guān)性,由此可以推斷其通過營養(yǎng)成分對底物發(fā)酵速率起到促進(jìn)或抑制作用。

（3）不同精粗比日糧對瘤胃氨氮濃度的影響

NH3-N是飼料蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其它非蛋白質(zhì)氮化合物分解的終產(chǎn)物,同時又是微生物合成菌體蛋白的原料,其濃度反映的是飼料中蛋白質(zhì)的降解情況。瘤胃NH3-N濃度在一定程度上反了特定日糧組成下蛋白降解與合成間所達(dá)到的平衡狀態(tài)。由表4可知兩試驗組氨氮濃度范圍是 6.56～25.33mg/100m L，處于已報道的最佳NH3-N濃度 (6.3～27.5 mg/100m l)范圍之內(nèi)（Murphy 等，1987；Ortega 等，1979）。 所以，本試驗中兩種精粗比日糧均使瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生了適當(dāng)?shù)腘H3-N濃度。本試驗表明，添加不同日糧會直接影響飼料蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解。

（4）不同精粗比日糧對瘤胃pH值的影響

瘤胃碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它們是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂和體脂的原料。VFA濃度在很大程度上影響瘤胃的pH值，而反過來瘤胃pH值對瘤胃微生物群落也有重要影響。pH值是反應(yīng)瘤胃發(fā)酵情況的發(fā)酵水平的綜合指標(biāo)，在1和2試驗組中，瘤胃pH值的范圍是6.43～6.52，處于Murphy等(1987)所報道的正常范圍內(nèi)。表明兩組日糧條件下瘤胃均處于正常發(fā)酵狀態(tài)。正常的瘤胃發(fā)酵pH值范圍,驗證了試驗是在正常的發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行的,同時也證明了試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

3.2 結(jié)論

從結(jié)果可知，1號樣品的消化率均高于2號樣品，而體外產(chǎn)氣量也表明1號樣品的產(chǎn)氣量比2號的高。在pH值正常的發(fā)酵情況下氨氮濃度也是1號樣品的高于2號樣品?？梢哉f不同比例的全混日糧在瘤胃中的消化和利用率不同，營養(yǎng)價值也有所不同。

然而，體外培養(yǎng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于反芻動物營養(yǎng)研究,得益于其技術(shù)簡便、費用低,以及相應(yīng)測定裝置的發(fā)展。但是，目前仍缺少對不同實驗室之間的試驗比較,各個實驗室之間的數(shù)據(jù)往往無法比較。同時,各個實驗室采用的具體的技術(shù)細(xì)節(jié)和裝置不同,難以制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化程序。此外,作為一種動物消化模擬技術(shù)關(guān)鍵在于與體內(nèi)環(huán)境相似,所以本實驗只給飼料營養(yǎng)價值評定中提供理論依據(jù)。

［1］楊勝.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1999.

［2］閆貴龍，魯琳等.氮肥追施量對玉米秸稈營養(yǎng)價值的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37(8)：785～792.

［3］Tilly J M A ,Terry R A.A two stage technique for the in vit ro digestion of forage crop s[J].JBr Grassland Soc,1963,18：104～111.

［4］盧德勛等.現(xiàn)代反芻動物營養(yǎng)研究方法和技術(shù)[M].農(nóng)業(yè)出版社,1993.

［5］謝春元,楊紅建等.體外發(fā)酵產(chǎn)氣技術(shù)在飼料營養(yǎng)價值評定中的應(yīng)用[J].中國飼料,2007,10：16-19.

［6］彭健,陳喜斌.飼料學(xué)（第二版）[M].科學(xué)出版社，2008.

［7］楊鳳.動物營養(yǎng)學(xué)（第二版）[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

［8］Picard D G,Tesser OB,Bianco R A M.Interference of nitorgenous in techniques of invitro rum inal gas production [J].Ciencia e Investigacion Agraria,1998,25(2)：227～232.

［9］張曉慶,吳秋玨等.不同品種苜蓿營養(yǎng)成分及體外消化率動態(tài)研究[J].草業(yè)科學(xué)，2005,12(12)：22.