番茄種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR分析

丘漫宇張素平郭爽李伯壽劉玉平

（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的蔬菜種類(lèi)之一，在我國(guó)也是一種重要的蔬菜作物，因其富含多種維生素、糖類(lèi)、番茄紅素和胡蘿卜素而廣受歡迎（劉仲齊等，2004）。目前市場(chǎng)上廣泛栽培的番茄品種大多為雜交種。在雜交種選育過(guò)程中，種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系是作為親本選擇和雜交配組的主要依據(jù)。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的成熟和發(fā)展，其在鑒定蔬菜種質(zhì)材料親緣關(guān)系中的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯，SSR標(biāo)記以其多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、信息量大和PCR技術(shù)方便等優(yōu)勢(shì)（艾呈祥 等，2005），正被廣泛的應(yīng)用于蔬菜遺傳多樣性的應(yīng)用研究中。

本試驗(yàn)旨在利用 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的番茄高代自交系進(jìn)行親緣關(guān)系分析，劃分雜種優(yōu)勢(shì)群，為今后利用雜交優(yōu)勢(shì)育種提供理論依據(jù)。同時(shí)對(duì)已育成的番茄品種金豐1號(hào)、年豐、益豐的親本進(jìn)行遺傳距離測(cè)定，初步探討親本的分子標(biāo)記遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)共選擇了20份番茄育種材料（表1），其中 No.1、No.2、No.3、No.5、No.6、No.8和No.9是自封頂類(lèi)型，其余13份材料為無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型，No.18是長(zhǎng)貨架材料。No.3和No.4是雜交一代番茄品種金豐1號(hào)的父本和母本，No.5和No.8是雜交一代番茄品種年豐的父本和母本，No.6和No.7是雜交一代番茄品種益豐的父本和母本。2011年8月12日在溫室播種，9月8日定植大棚，每份材料定植20株，待幼苗長(zhǎng)至6～7片真葉時(shí)混株取3～4片嫩葉于離心管中，-20 ℃保存，以備提取DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)Suliman-Pollatschek等（2002）的方法及SGN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.sgn.cornell.edu）的數(shù)據(jù)，選取25對(duì)在番茄中可能具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，對(duì)20份番茄高代自交系育種材料（表1）進(jìn)行親緣關(guān)系分析，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取及檢測(cè) 采用改良的CTAB法（Clark，1998）提取番茄葉片總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA條帶完整性，采用UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，檢測(cè)純度和濃度，并稀釋為20 ng·μL-1，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增反應(yīng)在Thermo PX2 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、1.6 mmol·L-1MgCl21.5 μL、0.2 μmol·L-1dNTP 2 μL、0.36 μmol·L-1Primer 正反向各 1 μL、2.5 UTaq酶 0.2 μL、20 ng模板 DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR 反應(yīng)過(guò)程：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%變性聚丙稀酰胺凝膠上電泳，銀染檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 在擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜中的同一遷移位置上，有擴(kuò)增條帶的記為1，無(wú)擴(kuò)增條帶的記為0，得到各樣品帶型分布表。采用POPGEN32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率P（%）、相似系數(shù)和遺傳距離（GD），并用MTSUS2.11版軟件的非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)。

表1 20份番茄材料的編號(hào)及類(lèi)型

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用25對(duì)SSR引物對(duì)20份番茄材料進(jìn)行SSR分子鑒定。結(jié)果表明，有21對(duì)引物可以在番茄材料上擴(kuò)增出條帶，18對(duì)引物具有多態(tài)性，引物7的SSR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。從21對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果中共統(tǒng)計(jì)到66條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶為52條，多態(tài)率為78.8%，譜帶大小為100～1000 bp。最少的可擴(kuò)增出1條條帶，最多的可擴(kuò)增出6條條帶，平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出3.1條條帶，其中引物10擴(kuò)增出的多態(tài)性譜帶最多。

圖1 引物7對(duì)20份番茄材料的SSR擴(kuò)增圖譜

2.2 遺傳距離分析

遺傳距離是衡量樣品間相似性程度的度量，遺傳距離數(shù)值越大表明材料間的差異越明顯。采用UPGMA法對(duì)SSR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，結(jié)果表明20份番茄材料兩兩間的遺傳距離（GD）在1.4892～9.1806之間，遺傳距離大于7的育種材料有18份，其中No.1與No.15之間的遺傳距離最大，為9.1806，表明這些材料間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以據(jù)此指導(dǎo)田間的育種實(shí)踐，減少親本選擇和雜交配組的盲目性。

No.3與No.4為金豐1號(hào)的父本和母本，遺傳距離為2.6817；No.5與No.8為年豐的父本和母本，遺傳距離為3.2052；No.6與No.7為益豐的父本和母本，遺傳距離為7.1931。在生產(chǎn)實(shí)際中，益豐的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等田間表現(xiàn)均明顯優(yōu)于金豐1號(hào)和年豐?？梢?jiàn)，這3個(gè)番茄品種的田間表現(xiàn)與其親緣關(guān)系的分子檢測(cè)結(jié)果一致，即親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜種優(yōu)勢(shì)越明顯。

2.3 聚類(lèi)分析

圖2 20份番茄材料SSR標(biāo)記的聚類(lèi)分析圖

從SSR標(biāo)記的遺傳聚類(lèi)分析圖可以看出（圖2），以遺傳相似系數(shù)0.67為標(biāo)準(zhǔn)可將20份番茄育種材料劃分為4大類(lèi)，第1類(lèi)共有13份材料，包括6份自封頂類(lèi)型和7份無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型；第2類(lèi)共有4份材料，均為無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型；第3類(lèi)有2份材料，1份為自封頂類(lèi)型，1份為無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型；第4類(lèi)只有No.181份材料，為無(wú)限生長(zhǎng)類(lèi)型的長(zhǎng)貨架材料，與其余19份番茄材料的遺傳距離介于4.5153～7.6303之間，表明長(zhǎng)貨架材料的遺傳背景較常規(guī)番茄育種材料的遺傳差異較大，育種實(shí)踐中可以考慮引入長(zhǎng)貨架育種材料來(lái)改善番茄育種材料的結(jié)構(gòu)，突破目前遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄的局限。金豐1號(hào)和年豐的父母本均聚在了第1類(lèi)，表明它們之間的遺傳相似系數(shù)較大，親緣關(guān)系較近；益豐的父本和母本遺傳距離較遠(yuǎn)，分別聚在了第1類(lèi)和第3類(lèi)。

3 結(jié)論與討論

雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱取決于雙親性狀間的互補(bǔ)性，在一定范圍內(nèi)，雙親的基因差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜種優(yōu)勢(shì)就越明顯。遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析是番茄遺傳育種研究的重要內(nèi)容，有利于雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分，在育種實(shí)踐中指導(dǎo)親本的選擇和選配。而DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究提供了新的手段和方法（金鳳媚 等，2004）。在番茄遺傳多樣性研究中，趙凌俠等（2002）用RAPD分子標(biāo)記對(duì)番茄屬9個(gè)種的43份材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將43份材料分為4個(gè)類(lèi)群。姚祝平等（2010）利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)44份番茄材料進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從64對(duì)引物組合中篩選出15對(duì)用于擴(kuò)增，共獲得364條多態(tài)性條帶，將44份番茄材料分成5個(gè)復(fù)合組和1個(gè)獨(dú)立組。

本試驗(yàn)選用了在育種實(shí)踐中用于配制雜交組合或?qū)⒂糜谂渲平M合的 20份高代純系番茄育種材料作為供試材料，意在將田間育種實(shí)踐與實(shí)驗(yàn)室理論分析相結(jié)合，有針對(duì)性的分析育種材料之間的遺傳距離，明確這些育種材料間的親緣關(guān)系，一方面為田間育種實(shí)踐提供理論依據(jù)和參考，另一方面為實(shí)驗(yàn)室理論分析尋找田間實(shí)證。從這些材料中選擇遺傳距離較大的材料進(jìn)行雜交組合，在一定程度上可以減少田間親本選擇和雜交配組的盲目性。

本試驗(yàn)的聚類(lèi)分析結(jié)果中，并沒(méi)有將生長(zhǎng)類(lèi)型相同的材料全部劃分為一類(lèi)，而是在各類(lèi)群間交叉出現(xiàn)，這可能是由于以下兩方面原因造成的：首先，由于供試材料均為高代自交系育種材料，材料之間經(jīng)過(guò)了多代的雜交和回交，難免會(huì)出現(xiàn)遺傳背景的交叉；其次，生長(zhǎng)類(lèi)型只是其所有性狀的一個(gè)組成部分，并不能代表所有基因組的組成，同時(shí)并沒(méi)有針對(duì)生長(zhǎng)類(lèi)型進(jìn)行引物的特異選擇，從而無(wú)法將不同的生長(zhǎng)類(lèi)型完全區(qū)分開(kāi)，因此出現(xiàn)交叉現(xiàn)象。所以，在今后的親緣關(guān)系分析中，在引物的選擇方面，可以考慮針對(duì)特定的某幾個(gè)目標(biāo)性狀，選擇針對(duì)性較強(qiáng)的引物進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。

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