辣椒素類物質(zhì)生物合成途徑及其相關(guān)基因研究進(jìn)展

吳智明 程蛟文 唐 鑫 胡開林*

（1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東廣州 510225；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642）

辣椒（CapsicumannuumL.）通常具有特殊的辛辣味，這主要是由于其果實(shí)中含有特殊的以辣椒素（capsaicin）為主的辣椒素類物質(zhì)（capsaicinoids）。辣椒素的含量是評估辣椒果實(shí)品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)之一，同時(shí)辣椒素在當(dāng)今食品（Perkins et al.，2002）、醫(yī)藥（Liu & Nair，2010）、軍事（Reilly et al.，2001）和農(nóng)藥（劉新和林永，2003）等領(lǐng)域的應(yīng)用也非常廣泛，因此對于辣椒素的研究一直是農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

辣椒素類物質(zhì)的生物合成與積累主要受遺傳基因控制，但同時(shí)也受到發(fā)育與外界環(huán)境條件的影響，不同辣椒品種或同一辣椒品種不同的生長發(fā)育階段在辣度上均表現(xiàn)出很大的差異（Kozukue et al.，2005；Mueller-Seitz et al.，2008；李光光 等，2010）。了解辣椒素類物質(zhì)在辣椒果實(shí)中的生物合成途徑及其主要基因的功能，以及基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有助于人工調(diào)控辣椒素類物質(zhì)的生物合成，對辣椒優(yōu)質(zhì)新品種選育具有重要的實(shí)踐意義。

1 辣椒素類物質(zhì)的種類

辣椒素最早是由Thresh在1876年從辣椒果實(shí)中分離出來的。1919年，Nelson（1919）報(bào)道了辣椒素的結(jié)構(gòu)，并命名為8-甲基-6-癸烯香草基胺，分子式為C18H27NO3，是一種含香草酰胺的生物堿。此后，又有一些辣椒素的同系物相繼從辣椒果實(shí)中被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為辣椒素類物質(zhì)。所有辣椒素類物質(zhì)都是C9～C11支鏈脂肪酸和香草基胺合成的酰氨化合物，不同辣椒素類物質(zhì)的主要差異在于脂肪側(cè)鏈長度、是否存在雙鍵、分支點(diǎn)和相對辣度。據(jù)報(bào)道，迄今為止己發(fā)現(xiàn)近20種辣椒素類物質(zhì)（Mazourek et al.，2009），主要包括辣椒素、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin）、降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）、高二氫辣椒素（homodihydrocapsaicin）和高辣素（homocapsaicin）等，5種主要的辣椒素類物質(zhì)及其相關(guān)特性見表1。后來，又在甜椒果實(shí)中發(fā)現(xiàn)兩種無辣味的類辣椒素物質(zhì)（capsaicinoid-like substance，CLS）：辣椒素酯（capsiate）和二氫辣椒素酯（dihydrocapsiate），辣椒素酯具有與辣椒素類物質(zhì)相同的側(cè)鏈脂肪酸，但芳香成分卻被香莢蘭醇（vanillyl alcohol）代替，有學(xué)者推測其可能是辣椒素類物質(zhì)合成的前體物（Kobata et al.，1998）。

表1 辣椒素類物質(zhì)包含的主要種類及其特性

2 辣椒素類物質(zhì)的生物合成

前期對辣椒素類物質(zhì)在辣椒植株中的合成部位存在一定的爭議。20世紀(jì) 60年代，有學(xué)者認(rèn)為種子是辣椒素類物質(zhì)的合成部位，也有學(xué)者則認(rèn)為子房隔膜上的有些腺體細(xì)胞可以分泌辣椒素。1979年，Iwai等（1979）采用同位素示蹤技術(shù)，研究認(rèn)為辣椒素類物質(zhì)在辣椒果實(shí)的胎座中積累。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，辣椒素主要在果實(shí)胎座表皮細(xì)胞的液泡中形成和積累，再通過子房膜（壁）運(yùn)輸?shù)焦獗砥ぜ?xì)胞的液泡中積累起來。辣椒素在果實(shí)不同部位的含量不同，胎座中的辣椒素含量最高，果肉次之，種子最低（Estrada et al.，2002），而果皮中的辣椒素以果實(shí)中段最多，近萼片端次之，近尖端最少（鄒學(xué)校，2002）。對于辣椒素在辣椒果實(shí)中的合成時(shí)期，目前普遍認(rèn)為，絕大多數(shù)的辣椒品種中辣椒素類物質(zhì)的生物合成發(fā)生在開花后約20 d（Iwai et al.，1979）。

辣椒素類物質(zhì)的生物合成途徑相當(dāng)復(fù)雜，這也導(dǎo)致了辣椒素類物質(zhì)的多樣性。關(guān)于辣椒素類物質(zhì)的生物合成途徑的研究始于20世紀(jì)60年代末。研究者通過同位素示蹤技術(shù)研究辣椒素類物質(zhì)合成的前體，發(fā)現(xiàn)部分香草基胺的合成前體是苯丙氨酸，而支鏈脂肪酸源于纈氨酸（Bennett ＆ Kirby，1968；Leete ＆ Louden，1968）。由此推測辣椒素類物質(zhì)生物合成途徑包含兩條途徑：以苯丙氨酸為前體的苯丙烷途徑和以纈氨酸或亮氨酸為前體的支鏈脂肪酸途徑。最近，Mazourek等（2009）在前人的研究基礎(chǔ)上全面、詳細(xì)總結(jié)了辣椒素類物質(zhì)的生物合成途徑，并建立了辣椒素類物質(zhì)生物合成模型（CapCyc Model）（圖1）：辣椒素類物質(zhì)生物合成起始于莽草酸途徑（shikimate pathway），在質(zhì)體中先形成分支酸（chorismate）（步驟①），然后合成苯丙氨酸（phenylalanine）（步驟②）；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基肉桂酰輔酶A（feruloyl-CoA）（步驟③），隨后由羥基肉桂酰輔酶 A裂解酶催化合成香草基胺（vanillylamine）（步驟④）。丙酮酸酯是纈氨酸的合成前體（步驟⑤），隨后纈氨酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中催化合成異丁?；?CoA（isobutyryl-CoA）（步驟⑥）；合成的異丁?；?CoA再轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體中，在脂肪酸合酶催化下合成8-甲基-6-壬烯酸（8-methyl-nonenoic acid）（步驟⑦）；8-甲基-6-壬烯酸從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)過程中合成硫代酸酯-CoA（8-methylnonenoic-CoA）。最后，硫代酸酯-CoA和香草基胺在辣椒素合成酶（CS）催化下合成辣椒素（步驟⑧），然后轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞中辣椒素類物質(zhì)生物合成示意圖及合成途徑

3 辣味基因的標(biāo)記與QTL定位

早期的遺傳學(xué)研究認(rèn)為，辣椒辣味的產(chǎn)生是由單一顯性基因C（Pun1）控制的，在純合隱性基因c（pun1）作用下表現(xiàn)為辣味缺失，并且該基因?qū)λ衅渌睦蔽断嚓P(guān)基因具有上位作用（Greenleaf，1952）。Tanksley等（1988）最先找到了一個(gè)與C基因連鎖的分子標(biāo)記CD35，但遺傳距離大于10 cM。Ben-Chaim等（2001）最先將C基因位點(diǎn)定位于辣椒的第2號染色體上。后來，Blum等（2002）以甜椒品種Maor（Capsicum annuum）與高辣辣椒BG2816（Capsicum frutescens）為親本，構(gòu)建了包含242個(gè)單株的F2群體，通過RFLP標(biāo)記方法，遺傳作圖證實(shí)C基因位于第2號染色體上，并首次獲得了與C基因緊密連鎖的3個(gè)RFLP標(biāo)記和1個(gè)離C基因位點(diǎn)僅0.4 cM的CAPS標(biāo)記。隨后，Blum等（2003）在前期構(gòu)建的F2群體基礎(chǔ)上，利用BSA法篩選到3個(gè)在不辣基因池與辣味基因池之間表現(xiàn)多態(tài)性的RAPD標(biāo)記位點(diǎn)，通過成功轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記后，將其中的一個(gè)主效QTL位點(diǎn)cap定位于辣椒的第7號染色體上，實(shí)驗(yàn)證明該QTL位點(diǎn)可解釋在不同生境條件下表型變異的34%～38%。Lee等（2005）在一年生辣椒（Capsicum annuum）中分離到一個(gè)與C基因共分離的辣椒素合成酶基因（Capsaicin Synthase，CS），序列分析表明甜椒的CS基因5’上游區(qū)域存在一段2529 bp堿基缺失。

Ben-Chaim等（2006）以微辣辣椒品種 NuMex RNaky（Capsicum annuum）與高辣品種BG2814-6（Capsicum frutescens）為親本，構(gòu)建了包含396個(gè)單株的F2群體及相應(yīng)的F3群體，同時(shí)構(gòu)建了包括 SSR、AFLP、RFLP共 728個(gè)標(biāo)記的分子圖譜，找到了 6個(gè)與辣椒素類物質(zhì)含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，并分別定位于第 3、4和 7號染色體上。分析表明，辣椒素類物質(zhì)含量表型變化主要貢獻(xiàn)（24%～42%）來自于主效QTL位點(diǎn)cap7.1和定位于2號染色體無主效作用的標(biāo)記（NP0326）間的二基因作用，而QTL位點(diǎn)cap7.2很可能是Blum等（2003）證實(shí)的對辣椒素類物質(zhì)含量有顯著影響的QTL位點(diǎn)cap。Stewart等（2007）在C. chinense辣椒中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Pun1基因的等位基因位點(diǎn)，并命名為pun12。序列分析發(fā)現(xiàn)pun12位點(diǎn)存在4個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生移碼突變，最終導(dǎo)致辣椒辣味的散失。王巖等（2007）通過同源克隆法，從不同基因型辣椒中克隆了C基因的全長，序列比對分析證實(shí)，甜椒C基因5’端約689 bp的堿基缺失可能是造成其辣味散失的原因。最近，Stellari等（2010）又在另一個(gè)辣椒種Capsicum frutescens中發(fā)現(xiàn)了新的等位基因位點(diǎn)pun13，實(shí)驗(yàn)證明pun13轉(zhuǎn)錄本的缺失與辣椒辣味的散失相關(guān)。Wyatt等（2012）在前人研究基礎(chǔ)上發(fā)展了一套標(biāo)記，用以區(qū)別不同辣椒種中Pun1、pun11、pun12和pun13基因型，這些標(biāo)記的獲得為辣椒種質(zhì)資源的鑒定與辣椒育種提供了很好的參考。

4 辣椒素類物質(zhì)生物合成過程中基因的克隆

辣椒素的合成與累積除受結(jié)構(gòu)基因C影響外，還受到諸多調(diào)控基因的控制。為了通過基因工程方法調(diào)控辣椒素的含量，探討辣椒素生物合成的分子機(jī)理，研究者長期以來對辣椒素生物合成途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行了克隆，并研究了相關(guān)基因表達(dá)與辣味之間的關(guān)系。到目前為止，已克隆的與辣椒素類物質(zhì)生物合成相關(guān)的酶類基因超過50種（表2）。

其中，Curry等（1999）最先從轉(zhuǎn)錄水平檢測了不同基因型辣椒果實(shí)發(fā)育過程中辣椒素合成相關(guān)酶的表達(dá)，從辣椒（C. chinense）胎座cDNA文庫中篩選獲得了參與辣椒素合成的3個(gè)特異酶基因：苯丙氨酸裂解酶（Pal）、肉桂酸羧化酶（Ca4h）和咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶（Comt），研究表明，在辣椒果實(shí)發(fā)育過程中，這些基因的轉(zhuǎn)錄水平與辣椒素合成量呈正相關(guān)。Kim等（2001）利用抑制差減雜交（SSH）技術(shù)獲得了4個(gè)與辣椒素代謝有關(guān)的基因片段。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，這些片段與氨基轉(zhuǎn)移酶（pAMT）、3-氧?；蝉；d體蛋白〕還原酶（Kas）、乙?；D(zhuǎn)移酶（AT）、脂肪酸乙醇氧化酶（FAO）序列有較高同源性，這些基因在辣椒果實(shí)胎盤中特異表達(dá)，表達(dá)水平與辣椒素積累具有相同的模式。Aluru等（2003）研究脂肪酸合成酶復(fù)合物組成因子與辣味關(guān)系，通過差顯的方法克隆了Kas、酰基載體蛋白（Acl）和硫酯酶（Fat）基因，并分別將它們定位于第1、1和6連鎖群，實(shí)驗(yàn)證明KAS蛋白的積累與辣椒辣味呈正相關(guān)。Stewart等（2005）在Kim等（2001）分離的一個(gè) EST（SB2-66）基礎(chǔ)上，通過RACE方法獲得了Pun1基因全長，并將其命名為AT3。研究認(rèn)為Pun1基因編碼一個(gè)在辣椒素合成過程中非常重要的酶，它可能是一個(gè)乙?；D(zhuǎn)移酶。研究發(fā)現(xiàn)，AT3活性和表達(dá)量與辣味積累呈正相關(guān)，免疫方法證實(shí)AT3特異性定位到辣椒果實(shí)胎座，說明AT3可能是辣椒素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因。同時(shí)他們提出早期在Capsicum annuum的馴化中，決定不辣的Pun1位點(diǎn)上的缺失可能在種間廣泛存在。Lee等（2006）從表達(dá)差異蛋白角度入手，綜合采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究了辣味和無辣味辣椒果實(shí)胎座組織抽提物中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，結(jié)果表明 22個(gè)蛋白點(diǎn)在辣味辣椒中強(qiáng)烈表達(dá)，在無辣味辣椒果實(shí)胎座中則沒有相對應(yīng)的蛋白點(diǎn)。del Rosario Abraham-Juarez等（2008）利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)研究了Comt、pAMT和Kas基因表達(dá)水平與辣椒素的積累量關(guān)系，其中任何一個(gè)基因的沉默都會(huì)導(dǎo)致辣椒素含量的急劇下降。Lang等（2009）研究發(fā)現(xiàn)甜椒 CH-19是由有辣味辣椒pAMT基因在1291 bp處插入了一個(gè)堿基T，產(chǎn)生新的終止密碼子TGA突變得到的。最近，Mazourek等（2009）定位并克隆了幾十種辣椒素類物質(zhì)生物合成過程中相關(guān)的酶類基因，如表2所示。

5 展望

辣椒素作為辣椒重要品質(zhì)性狀和醫(yī)藥、工業(yè)的重要原料，對其生物合成路徑以及相關(guān)基因的表達(dá)、辣椒素含量的分子標(biāo)記研究等都取得了重要進(jìn)展。但目前的研究還沒有明確辣椒素類物質(zhì)生物合成路徑的調(diào)控機(jī)制，包括一些關(guān)鍵基因的定位、克隆和調(diào)控的分子機(jī)理，相關(guān)基因啟動(dòng)子的分離和調(diào)控作用。而且，到目前為止，還沒有真正能夠利用基因工程的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，能自由調(diào)控辣椒果實(shí)中辣椒素的合成。這些都應(yīng)該成為下一步研究的重點(diǎn)。

表2 與辣椒素類物質(zhì)生物合成途徑相關(guān)的酶

另外，辣椒素類物質(zhì)種類繁多，除了辣椒素外其他不同類型的辣椒素類物質(zhì)的生物合成過程還不清楚，而且一些環(huán)境因子如光照、溫度、水分、肥料等在辣椒素的生物合成與積累過程中起著非常重要的作用，這些環(huán)境因子是如何影響辣椒素在果實(shí)中的合成的分子機(jī)理還值得進(jìn)一步深入研究。

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