HPLC法測定鹽酸米諾環(huán)素緩釋片在犬體內(nèi)的血漿濃度及其藥動學(xué)研究

劉統(tǒng)斌，鄔向東，楊東菁，王雪芹（1.上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，河南商丘476000；.河南中帥醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，鄭州 45000；.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南開封 475001；4.河南省食品藥品檢驗所，鄭州45000）

鹽酸米諾環(huán)素（M inocycline Hydrochloride，MH）為半合成四環(huán)素類廣譜抗菌藥物，具有高效、長效的特點。在四環(huán)素類抗菌藥物中，本品的抗菌作用最強，抗菌譜與四環(huán)素相近而且對四環(huán)素耐藥性金黃色葡萄球菌也有效。參照文獻和我國新藥審批辦法中的有關(guān)規(guī)定[1～6]，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法測定犬血漿中的鹽酸米諾環(huán)素含量，并對鹽酸米諾環(huán)素緩釋片（以羥丙基甲基纖維素為骨架）與進口參比制劑在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)進行對比研究，以闡釋鹽酸米諾環(huán)素緩釋片的緩釋特征，為處方篩選和臨床研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP225D型電子天平（德國賽多利斯公司）；LC-6A HPLC儀，包括紫外檢測器（日本島津公司）。

1.2 試藥

鹽酸米諾環(huán)素對照品（批號：091001，含量：84.01%，使用前不需要干燥處理）和鹽酸米諾環(huán)素緩釋片（批號：20100508-1，規(guī)格：按米諾環(huán)素計每片90mg）均由河南中帥醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供；進口鹽酸米諾環(huán)素緩釋片（美國BarrLaboratories公司，批號：701550，規(guī)格：按米諾環(huán)素計每片90mg）；咖啡因（中國食品藥品檢定研究院，批號：171215-200406，純度：99%）；乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

Beagle犬，體重9～11 kg，♀♂各半，購自南京市安立默科技發(fā)展有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2005-0003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Scienhome C18（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-水（含1.5%三乙胺、2%庚烷磺酸鈉，磷酸調(diào)pH至 3.0）＝150 ∶30 ∶850（V/V/V），流速：1.0 m L·min－1；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；進樣量：50μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 貯備液的制備。稱取鹽酸米諾環(huán)素對照品適量，先用甲醇溶解，再用流動相稀釋制成濃度為500mg·L－1的溶液作為對照品貯備液；另取咖啡因（內(nèi)標(biāo)）適量，同法制成濃度為0.5mg·L－1的溶液作為內(nèi)標(biāo)貯備液，分別置于冰箱冷藏保存。2.2.2 對照品血漿的制備。先將濃度為500mg·L－1的對照品貯備液，依次用流動相稀釋成含鹽酸米諾環(huán)素250、125、50、25、12.5、6.25、3.125mg·L－1的對照品溶液，再加入內(nèi)標(biāo)貯備液和空白血漿，制備成含鹽酸米諾環(huán)素 10、5、2、1、0.5、0.25、0.125mg·L－1的對照品血漿。

2.3 血漿樣品的處理與測定

取血漿樣品0.5m L，加入濃度為0.5mg·L－1的內(nèi)標(biāo)貯備液100μL、pH7.2磷酸鹽緩沖液1m L，渦旋0.5m in，加乙酸乙酯5 m L，渦旋3 m in，3 500 r·m in－1離心10 m in，吸取上清液 4.0 m L，再于40℃水浴中N2吹干。加流動相100μL，渦旋2min，12 000 r·m in－1高速離心10m in，取上清液按“2.1”項下色譜條件測定鹽酸米諾環(huán)素的峰面積，以內(nèi)標(biāo)法進行定量分析。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

在“2.1”項色譜條件下，取給藥前犬的空白血漿、對照品血漿、犬給藥后2 h血漿樣品，按“2.3”項下方法處理并進樣測定。結(jié)果表明，鹽酸米諾環(huán)素達到基線分離，與血漿樣品中的內(nèi)標(biāo)及雜質(zhì)峰分離良好，保留時間約為6.42m in，內(nèi)標(biāo)咖啡因保留時間約為4.78min。色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.對照品血漿；C.血漿樣品（給藥后2 h）；1.鹽酸米諾環(huán)素；2.內(nèi)標(biāo)Fig 1 HPLC chromatograms A.blank plasma；B.controlsubstance plasma；C.plasma sample（2 h after adm inistration）；1.MH；2.internalstandard

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍考察

取空白血漿0.5m L，精密加入內(nèi)標(biāo)和不同量的鹽酸米諾環(huán)素對照品溶液，使其含鹽酸米諾環(huán)素分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10mg·L－1，再按“2.3”項下方法處理，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以濃度c（mg·L－1）為橫坐標(biāo)，鹽酸米諾環(huán)素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值R為縱坐標(biāo)進行線性回歸。得回歸方程為R＝0.219 9c+0.036 6（r＝0.999）。結(jié)果表明，鹽酸米諾環(huán)素的檢測濃度的線性范圍為0.125～10mg·L－1，定量下限為0.125mg·L－1。

2.6 回收率試驗

取不同濃度的鹽酸米諾環(huán)素對照品溶液，加空白血漿制備成濃度為5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，每個濃度各5份，以相應(yīng)濃度的對照品溶液為對照，由二者峰面積之比計算鹽酸米諾環(huán)素提取回收率和二者濃度之比計算方法回收率。結(jié)果，鹽酸米諾環(huán)素的平均提取回收率為70.3%，平均方法回收率為89.3%。

2.7 進樣重復(fù)性與精密度考察

按“2.6”項下方法制備5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，照“2.3”項下方法處理，于同日內(nèi)處理測定5次；另每日處理測定1次，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)和日間RSD。結(jié)果，本方法的日內(nèi)RSD≤5.3%，日間RSD≤6.4%。

2.8 樣品穩(wěn)定性試驗

按“2.6”項下方法制備5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，分別分組處理如下：（1）新鮮制備組：立即按“2.3”項下方法處理血漿樣品，并進樣測定；（2）短期室溫穩(wěn)定性組：將制備好的血漿樣品室溫放置10 h后，再按“2.3”項下方法處理、測定；（3）反復(fù)凍融組：將在－20℃下冷凍的血漿樣品取出室溫復(fù)融，反復(fù)3次后再按“2.3”項下方法處理、測定；（4）－20℃冷凍儲存組：將血漿樣品置于－20℃中冰凍20 d后，再按“2.3”項下方法處理、測定；（5）處理后樣品組：血漿樣品按“2.3”項下方法處理后室溫放置10 h，再進樣測定。結(jié)果，在上述條件下，RSD均＜15%，表明血漿樣品穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品的分析要求。

將鹽酸米諾環(huán)素貯備液分別放置0、7、14 d后，按“2.2.2”項下方法制備成濃度為1mg·L－1的溶液，進樣測定，根據(jù)鹽酸米諾環(huán)素峰面積及其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值變化情況評價貯備液的穩(wěn)定性。結(jié)果，鹽酸米諾環(huán)素峰面積的RSD及其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值的RSD均＜3.96%，說明鹽酸米諾環(huán)素貯備液的穩(wěn)定性較好。

2.9 樣品的采集與測定

取犬分為受試制劑（國產(chǎn)）組和參比制劑（進口）組，每組5只，禁食不禁水，14 h后灌胃給予相應(yīng)鹽酸米諾環(huán)素緩釋片18 mg·kg－1（按臨床常用劑量換算），給藥后繼續(xù)禁食6 h，分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、60 h采集各組犬前肢靜脈血4m L，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，分離血漿，按“2.3”項下方法處理血漿，以鹽酸米諾環(huán)素作為檢測對象，用HPLC法測定血漿樣品中鹽酸米諾環(huán)素的濃度。另經(jīng)1周的清洗期后，同法進行交叉實驗，繪制2種制劑在犬體內(nèi)的平均藥-時曲線，結(jié)果見圖2。

用DAS 2.0藥動學(xué)軟件計算2種制劑在犬體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果，受試制劑和參比制劑的tmax分別為（4.42±1.24）、（4.33±1.07）h，cmax分別為（4.29±1.13）、（4.34±0.83）mg·L－1，t1/2分別為（22.17±5.73）、（20.09±4.94）h，AUC0～60h分別為（48.19±16.64）、（48.31±15.00）mg·h·L－1，AUC0～∞分別為（54.81±16.39）、（53.62±16.01）mg·h·L－1。表明2種制劑在犬體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)無明顯差異。

3 討論

圖2 2種制劑在犬體內(nèi)的平均藥-時曲線Fig 2 M ean p lasma concentration-time curves of 2 preparations in dogs

鹽酸米諾環(huán)素制成緩釋片用于治療12周歲以上非結(jié)節(jié)性中度或重度尋常性痤瘡炎癥損傷患者。本次實驗選擇化學(xué)穩(wěn)定性好的咖啡因為內(nèi)標(biāo)[7]。用乙酸乙酯處理樣品，既能夠有效提取待測成分，又能夠有效去除樣本中基質(zhì)對色譜柱和儀器的污染，方法簡單，樣品需要量少，適合大批量生物樣品濃度的檢測。

綜上所述，本方法專屬性強、靈敏度高，可有效檢測犬血漿中鹽酸米諾環(huán)素濃度；國產(chǎn)與進口鹽酸米諾環(huán)素緩釋片比較藥動學(xué)參數(shù)無明顯差異。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2005.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2005.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅨB.

[4]齊 靖，蔣海松，吳琳華.HPLC法測定鹽酸米諾環(huán)素緩釋片主藥的含量[J].中國藥房，2009，20（10）：781.

[5]高守紅，溫 燕，鄔 蓉，等.注射用鹽酸米諾環(huán)素在健康人體的藥物動力學(xué)[J].藥學(xué)實踐雜志，2009，27（3）：193.

[6]宋慶翠，湯 震，仇益群.米諾環(huán)素膠囊對人體相對生物利用度的研究[J].中國藥業(yè)，2001，10（2）：27.

[7]周玲潔，顧麗華，王以儉，等.米諾環(huán)素注射劑的藥動學(xué)[J].中國新藥與臨床雜志，2005，24（10）：798.