5株H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析和豚鼠間傳播能力的評(píng)估

桑曉宇，高玉偉，李 林，丁 潔，朱曉文，張釗偉，于志君，張 坤，程凱慧，馮 娜，劉 紅，王鐵成，楊松濤，黃 耕，夏咸柱*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130062；3.吉林省長春市疾病控制中心，吉林長春130061)

1966年，H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)在北美首次由火雞體內(nèi)分離獲得[1]。我國于1992年首次在南方省份的雞體內(nèi)分離到H9N2亞型AIV。流行病學(xué)研究表明，H9N2亞型AIV可以感染多種禽類，其中包括雞、鵪鶉、鴕鳥、鴨子、鵝和火雞等。最近的研究顯示，H9N2亞型AIV不經(jīng)過適應(yīng)就能夠感染小鼠、豚鼠和雪貂等哺乳動(dòng)物，這表明H9N2亞型AIV在一定程度上具備了感染哺乳動(dòng)物的能力，并已有研究表明H9N2亞型AIV能夠在雪貂和小鼠中同群傳播[2-3]。近年來，中國南方地區(qū)和香港均出現(xiàn)了人感染H9N2亞型AIV的病例[4-6]。另外，也有H9N2亞型AIV感染豬的報(bào)道，而豬一直被認(rèn)作是流感病毒的“混合器”。雪貂是研究流感病毒傳播的最佳動(dòng)物模型，但由于其飼養(yǎng)條件高，價(jià)格較貴等原因，豚鼠逐漸成為研究流感病毒傳播的新的動(dòng)物模型，并已證明流感病毒血凝素蛋白(HA)受體結(jié)合特性與其傳播能力密切相關(guān)[7-8]。因此，本研究分析5株H9N2亞型AIV的HA蛋白分子特征，并以豚鼠為模型評(píng)價(jià)其在豚鼠體內(nèi)的復(fù)制能力和水平傳播能力，為進(jìn)一步研究AIV在哺乳動(dòng)物間水平傳播的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、雞胚、抗原及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 A/Chicken/Jilin/Hu-3/2006(H9N2)(CK/JL/06)由本研究室保存；A/Chicken/Shandong/Li-1/2009 (H9N2) (CK/SD/09)、A/Chicken/JN/Li-2/2010 (H9N2) (CK/JN/1/10)、A/Chicken/JN/Li-3/2010 (H9N2) (CK/JN/2/10)、A/Chicken/CHAI/1/2010(H9N2)(CK/CHAI/10)均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；Hartley品系，體質(zhì)量約300 g的雌性健康豚鼠購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，H1、H5、H9亞型的流感病毒血凝抑制(HI)抗體呈陰性，P2+實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)；9日齡～11日齡非免疫雞胚購自長春生物制品研究所；H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 HA基因的測(cè)序及參考病毒株的選擇 對(duì)5株病毒的HA基因進(jìn)行序列測(cè)定，并參考GenBank中登錄的病毒株序列(AF156380.1、AY743216.1、EF154962.1、 EF155125.1、 AF156378.1、 AF156448.1、HQ8719331.1、HQ221677.1、HQ221693.1、HQ221691.1、AJ404627.1)，采用MEGA4中的N-J方法構(gòu)建進(jìn)化樹，初步分析5株病毒HA蛋白的受體結(jié)合特性、裂解位點(diǎn)和潛在的糖基化位點(diǎn)等分子特征。

1.3 H9N2亞型AIV在豚鼠體內(nèi)的復(fù)制情況 將30只豚鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，速眠新麻醉，分別以滴鼻途徑接種5株MEM(青霉素1 000 u/mL，鏈霉素1 000 u/mL)稀釋至107EID50/200 μL的病毒，100 μL/鼻孔。接種后72 h每組取4只豚鼠迫殺，采集鼻甲骨、氣管、左肺、右肺、脾臟、肝臟、腎臟和腦進(jìn)行病毒分離。每組的另外2只觀察臨床癥狀至攻毒后第14 d。

1.4 H9N2亞型AIV在豚鼠中傳播能力的評(píng)估 將每組4只豚鼠中2只接種待測(cè)病毒株，作為感染組，24 h后在同一隔離器內(nèi)放入2只健康豚鼠，作為接觸感染組。所有豚鼠自接種后第2 d起每天采集鼻洗液進(jìn)行病毒滴定。觀察14 d后采集所有豚鼠血液，測(cè)定血清抗體。

1.5 豚鼠鼻洗液與臟器的病毒分離滴定 所采集的臟器樣品稱重后加入等重量體積比PBS，充分研磨離心，取上清液，以含有青霉素(1 000 u/mL)和鏈霉素(1 000 u/mL)的PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋；將采集的鼻洗液以含雙抗PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋，將不同稀釋度的病毒分別經(jīng)尿囊腔接種3枚9日齡～11日齡非免疫雞胚，37℃繼續(xù)孵化48 h～72 h，通過測(cè)定感染雞胚尿囊液的血凝活性判斷其是否感染，利用Reed-Muench法計(jì)算病毒含量。

1.6 豚鼠血清HI抗體的檢測(cè) 接毒后第14 d，采集并分離所有豚鼠血清，于56℃滅活30 min，經(jīng)受體破壞酶處理后，采用H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定HI抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 HA基因的序列分析 對(duì)HA基因序列進(jìn)行分析表明：5株病毒HA基因的開放閱讀框(ORF)均為1 683個(gè)堿基，編碼560個(gè)氨基酸；其核苷酸同源性為92.9%～99.3%。對(duì)5株病毒HA基因的進(jìn)化樹分析表明，其均屬于CK/Beijin譜系(圖1)。HA蛋白受體結(jié)合特性分析顯示，5株病毒中有2株的HA蛋白具有人樣受體結(jié)合位點(diǎn)(Leu226)，2株具有禽樣受體位點(diǎn)(Gln226)，但CK/JN/1/10株在該位點(diǎn)的氨基酸殘基為苯丙氨酸(Phe226)(表1)。5株病毒HA蛋白的裂解位點(diǎn)中，有3株病毒的裂解位點(diǎn)為PSRSSRG，另外2株病毒的為PARSSRG，均不具備高致病性AIV特征。HA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)(N-X-T/S，X為除脯氨酸外的其它氨基酸)的分析表明，5株病毒存在5個(gè)共同的糖基化位點(diǎn)(HA1亞基第29位、141位、218位、305位和HA2亞基第429位)，并且CK/SD/09株與其它4株病毒相比在第166位多了1個(gè)糖基化位點(diǎn)，但在第298位缺少1個(gè)。CK/JN/2/10、CK/JL/06和CK/CHAI/10株在HA2亞基第551位存在1個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.2 H9N2亞型AIV在豚鼠體內(nèi)復(fù)制結(jié)果 將5株H9N2亞型AIV滴鼻接種4只豚鼠，72 h后采集樣品進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果顯示，5株病毒均能夠在豚鼠的呼吸道復(fù)制。其中CK/CHAI/10和CK/JN/2/10在下呼吸道復(fù)制能力較弱。與下呼吸道相比，5株病毒均能夠在鼻甲骨處良好復(fù)制，平均病毒滴度為2.01 Log EID50/mL～4.5 Log EID50/mL(表 2)。所有豚鼠的脾臟、肝臟、腎臟、腦內(nèi)均未檢出病毒；試驗(yàn)期內(nèi)各組豚鼠均未表現(xiàn)臨床癥狀。

表1 病毒HA蛋白的RBS結(jié)合位點(diǎn)分析Table 1 Analysis of HA receptor binding domain of AIV

表2 豚鼠呼吸道組織病毒滴定結(jié)果Table 2 Virus titers in the respiratory tract of guinea pigs inoculated with 107EID50of AIV

2.3 H9N2亞型AIV在豚鼠體內(nèi)水平傳播的結(jié)果將5株H9N2亞型AIV分別接種2只豚鼠，24 h后每組隔離器中放入2只正常豚鼠。從接毒后第2 d開始采集鼻洗液，以9日齡～11日齡雞胚進(jìn)行病毒滴定，結(jié)果顯示，5株病毒均能夠從接毒豚鼠的呼吸道排毒并且最長排毒期為8 d；所有接觸組豚鼠14 d觀察期鼻洗液中均未檢測(cè)到病毒(圖2)。表3表明14 d后所有實(shí)驗(yàn)豚鼠的血清抗體效價(jià)。

3 討 論

根據(jù)HA基因可以將H9N2亞型AIV劃分為3個(gè)譜系，即CK/Beijing譜系、G1譜系以及Y439或Korean譜系[9]。本研究中病毒株均為2005年后分離自我國北方省份，宿主為雞。HA基因的進(jìn)化樹分析表明5株病毒均屬于CK/Beijing譜系。值得注意的是CK/JN/1/10株HA蛋白第226位氨基酸殘基為苯丙氨酸(F226)，已有研究表明該位點(diǎn)通常為亮氨酸(Leu226)或谷氨酰胺(Gln226)，并且與流感病毒受體結(jié)合特性有密切關(guān)系，新位點(diǎn)的出現(xiàn)是否會(huì)影響流感病毒受體特性和傳播能力，還需要進(jìn)一步研究。

表3 豚鼠血清中HI抗體滴度Table 3 Titrations of HI antibody in experimental infected guinea pig with 107EID50of AIV

宿主表達(dá)受體是影響流感病毒通過呼吸道傳播的重要因素。流感病毒感染宿主首先需要HA蛋白通過α-2，3糖苷鍵或α-2，6糖苷鍵連接唾液酸(SA)。Gao等用植物凝聚素免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)豚鼠呼吸道受體特異性，表明豚鼠鼻道和氣管的表皮細(xì)胞既表達(dá)α-2，3糖苷鍵SA又表達(dá)α-2，6糖苷鍵SA；而肺部主要是α-2，3糖苷鍵SA[10]。本研究中，5株病毒均能夠在豚鼠的鼻甲骨處良好的復(fù)制，并能夠于接種組豚鼠的鼻洗液中檢測(cè)到病毒，但在豚鼠間未發(fā)生同群傳播。研究表明，部分病毒株(CK/JN/1/10和CK/CHAI/10)接種豚鼠后前4 d的鼻洗液中病毒滴度較高，但沒有引起同群健康豚鼠感染，表明豚鼠的排毒量不是影響流感病毒傳播的重要因素，并且流感病毒的HA蛋白第226位氨基酸僅是影響流感病毒在哺乳動(dòng)物間傳播的一個(gè)因素。Gao等研究顯示H5N1亞型AIV HA蛋白的糖基化位點(diǎn)和PB2蛋白影響其在豚鼠間的傳播能力[10]。本研究中的5株病毒HA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)發(fā)生了增加或缺失，表明我國目前流行的H9N2亞型AIV在進(jìn)化中具有獲得在哺乳動(dòng)物間傳播能力的危險(xiǎn)性。因此，研究影響H9N2亞型AIV在哺乳動(dòng)物間傳播的因素，為預(yù)測(cè)和防控可能發(fā)生的流感大流行提供依據(jù)。

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