鹽酸多巴酚丁胺注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的建立

李逢春，李震（1.河南省食品藥品檢驗所，鄭州450003；.河南南陽市中心醫(yī)院，河南南陽473000）

鹽酸多巴酚丁胺注射液適用于器質(zhì)性心臟病時心肌收縮力下降而引起的心力衰竭，包括心臟直視手術(shù)后所致的低排血量綜合征作為短期支持治療使用；其可對心肌產(chǎn)生正性肌力作用，主要作用于β1受體，對α及β2受體作用相對較小，臨床應(yīng)用比較廣泛。在《中國藥典》2005年版二部收載的質(zhì)量標準[1]中，該品種項下無熱原檢查項，為了避免臨床輸液因細菌內(nèi)毒素污染引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、昏迷甚至死亡等輸液反應(yīng)，在《中國藥典》2010年版中加強了對該品種的質(zhì)量控制，增加了細菌內(nèi)毒素的檢查項[2]。為此，筆者采用鱟試劑（TAL）法對鹽酸多巴酚丁胺注射液中細菌內(nèi)毒素檢查的可行性進行了研究。

1 儀器與試藥

DC-3A型干式恒溫器（南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司）。

鹽酸多巴酚丁胺注射液（浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號：20090312；上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：090501；廣東南國藥業(yè)有限公司，批號：090407；山東方明藥業(yè)股份有限公司，批號：0907022。以上各廠家產(chǎn)品規(guī)格均為20 mg∶2 mL）；TAL（湛江安度斯生物有限公司，批號：0710262，靈敏度：0.5 EU·mL－1；批號：0902132，靈敏度：0.125 EU·mL－1。福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：08020912，靈敏度：0.5 EU·mL－1。湛江博康海洋生物有限公司，批號：0901122，靈敏度：0.125 EU·mL－1。以上各廠家產(chǎn)品規(guī)格均為每支0.5 mL）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（WSE，批號：150601-200862，效價：每支120 EU）、細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號：W2008-4，規(guī)格：每支10 mL）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL標示靈敏度（λ）的復(fù)核

依法[1]對試驗用的TAL進行靈敏度復(fù)核。結(jié)果，4批TAL靈敏度測試值（λc）均在0.5λ～2.0λ之間，表明靈敏度符合規(guī)定，可用于試驗。

2.2 樣品內(nèi)毒素限值（L）的確定

按照《中國藥典》相關(guān)方法[1]，根據(jù)公式L＝K/M確立：K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU·kg－1·h－1；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。參照該品種藥品說明書及《臨床用藥須知》[1，3]，該品種成人常用量為250 mg，人均體重按60 kg計，一般加入到5%葡萄糖注射液中，滴注速度2.5～10 μg·kg－1·min－1，考慮到其是用于休克的心血管活性藥物，標準從嚴，滴注時間按1 h來計算，故M＝250 mg·60 kg－1·h－1＝4.2 mg·kg－1·h－1，則L＝1.2 EU·mg－1。

2.3 樣品預(yù)干擾試驗

采用靈敏度（λ）為0.5 EU·mL－1的TAL，則樣品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝cL/λ＝24倍，采用不超過MVD即3、6、12、24倍的溶液（濃度分別為3.3、1.7、0.8、0.4 mg·mL－1）作為供試品管（NPC）系列溶液，根據(jù)使用TAL的靈敏度，在其中分別加入2λ的細菌內(nèi)毒素，制成樣品陽性溶液作為PPC系列溶液。用λ＝0.5 EU·mL－1的TAL，分別與4個系列溶液反應(yīng)，各重復(fù)2管，同時作陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管，做2個批號樣品預(yù)干擾試驗[1，4]。結(jié)果見表1（注：表中“+”表示TAL安瓿從恒溫箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，所形成凝膠不變形，不滑脫；“-”表示未形成凝膠或凝膠不堅實，變形并滑脫）。

表1 預(yù)干擾試驗結(jié)果Tab 1 Results of preliminary interference test

2.4 樣品正式干擾試驗

使用2個批號的TAL，對4批鹽酸多巴酚丁胺注射液進行12倍稀釋（0.8 mg·mL－1）作正式干擾試驗[1，4]，得到Es（BET水制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值）和Et（供試品溶液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度幾何平均值）值，結(jié)果見表2。

表2 干擾試驗結(jié)果Tab 2 Results of interference test

由表2結(jié)果可見，4批鹽酸多巴酚丁胺注射液的12倍稀釋液（0.8 mg·mL－1）對2個廠家的TAL干擾試驗結(jié)果為：Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范圍內(nèi)，Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）范圍內(nèi)，說明該樣品進行12倍稀釋后確已排除干擾作用。

2.5 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取4批樣品，采用λ為0.125 EU·mL－1的TAL，以L為1.2 EU·mg－1作為結(jié)論評定標準，依法[1]進行操作和結(jié)果判斷，詳見表3。

表3 4批樣品的細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 3 Results of endotoxin detection of 4 batches of sample

由表3結(jié)果顯示，4批鹽酸多巴酚丁胺注射液采用2個廠家TAL作細菌內(nèi)毒素檢查[1]，結(jié)果均小于限值（1.2 EU·mg－1），說明可用此限值進行該樣品細菌內(nèi)毒素檢查。

3 討論

細菌內(nèi)毒素檢查法與家兔熱原檢查法比較，有勞動強度低、快捷、經(jīng)濟、靈敏和易于標準化等優(yōu)點，比家兔法更適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展。因此，《中國藥典》自1990年版開始收載該法以來，運用細菌內(nèi)毒素檢查法品種逐步增多。

細菌內(nèi)毒素檢查法機制涉及一種復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，因為細菌內(nèi)毒素是親水與疏水雙重活性的兩性分子，其主要毒性部位是類脂A端，溶解過程如不劇烈振蕩，疏水性的類脂A端極易與試管壁接觸而不能與TAL充分接觸，在試驗中會造成假陰性的結(jié)果，所以，在內(nèi)毒素的溶解稀釋過程中，每一步應(yīng)嚴格按要求在旋渦混合器上充分振搖。

由試驗結(jié)果表明，鹽酸多巴酚丁胺注射液稀釋到0.8 mg·mL－1濃度時對TAL和細菌內(nèi)毒素的反應(yīng)沒有干擾作用。因此，本品采用限值1.2 EU·mg－1進行細菌內(nèi)毒素檢查是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄ⅪE.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：690.

[3]國家藥典委員會.臨床用藥須知（化學(xué)藥和生物制品卷）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：178.

[4]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：287.