熊膽丸的質(zhì)量標準研究

鄧茂芝，趙常軍，彭雪芬，楊建春（.江西宜春市食品藥品檢驗所，江西宜春336000；.江西宜春市第六人民醫(yī)院，江西宜春 336000）

熊膽丸是由龍膽、黃連、大黃、梔子、冰片、薄荷腦、熊膽等16味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱散風(fēng)、止痛退翳之功效。用于治療風(fēng)熱或肝經(jīng)濕熱引起的目赤腫痛、羞明多淚等證。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第2冊[1]。在日常藥品監(jiān)督檢驗中，常常會發(fā)現(xiàn)該藥內(nèi)容物凝結(jié)成柱狀或團塊狀，按標準檢驗僅有性狀、檢查2項常規(guī)項目，而無其他檢驗項目，因而不能有效監(jiān)控該制劑內(nèi)在質(zhì)量。

為進一步加強該品種的質(zhì)控，并根據(jù)國家藥品標準提高行動計劃中中成藥品種增修訂項目任務(wù)表的要求，筆者在原標準的基礎(chǔ)上，增加了熊膽、龍膽、梔子、黃連的薄層色譜（TLC）鑒別以及冰片、薄荷腦的含量測定方法。

1 儀器與試藥

7890A氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；BP211D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；KG-250DB超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

熊去氧膽酸（批號：732-8702）、鵝去氧膽酸（批號：806-9101）、龍膽苦苷（批號：110770-200308）、梔子苷（批號：110749-200511）、鹽酸小檗堿（批號：110713-200208）、冰片（批號：110743-200905）、薄荷腦（批號：110728-200506）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；熊膽丸共15批次，均從本轄區(qū)內(nèi)醫(yī)藥批發(fā)、零售藥店抽驗而來，批號為20081101、071201039、20090501、090917、20080501、20070901、071030、20080601、20081003、20070503、080303030、090211、090603、090901122、090501200；制劑中各藥材均為市售品，由江西省宜春市食品藥品檢驗所鄢愛勇副主任中藥師鑒定為真品；硅膠G、GF254（青島海洋化工有限公司）；甲醇、三氯甲烷、石油醚（30～60℃）、乙酸乙酯、冰醋酸、乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、水楊酸甲酯、無水乙醇均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 熊膽的TLC鑒別[2～9]

取本品20粒內(nèi)容物，加甲醇25 mL，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取20 min，過濾，水浴蒸干，殘渣加20%氫氧化鈉溶液15 mL，置120～140℃的液體石蠟浴中加熱回流7 h，放冷，加鹽酸調(diào)pH值為2～3，加水10 mL，搖勻，用三氯甲烷提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取處方中不含熊膽的其他藥材按制備方法制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；取熊去氧膽酸對照品、鵝去氧膽酸對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；另取供試品溶液及對照品溶液按1∶1混合，搖勻，制得陽性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述5種溶液各4～7μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶4∶2.5∶2.5）為展開劑，展開，展距約13 cm，取出，晾干；再以上述展開劑展開1次，展距13 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點清晰，分別在日光、紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與2種對照品及陽性對照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。熊膽的TLC見圖1。

圖1 熊膽的TLCA.日光檢視；B.紫外光燈（365 nm）檢視；1～3.供試品；4.熊去氧膽酸對照品；5.鵝去氧膽酸對照品；6.陽性對照；7.缺熊膽陰性對照Fig 1 TLC of bear gallA.under sunlight；B.under uvligh（t365 nm）；1～3.test samples；4.ursodeoxycholic acid control；5.chenodeoxycholic acid control；6.positive control；7.negative control without bear gall

2.2 黃連的TLC鑒別[10]

取本品4粒內(nèi)容物，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，棄去乙醚液，殘渣加甲醇30 mL，回流提取30 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，作為供試品溶液；另取處方中缺黃連的其他藥材按制備工藝制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各2～5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-氨水（30∶2∶5∶7）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。黃連的TLC見圖2。

2.3 龍膽、梔子的TLC鑒別[11～15]

取本品10粒內(nèi)容物，加石油醚20 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇20 mL，回流2 h，濾過，濾液濃縮至約3 mL，加中性氧化鋁（100～200目）9 g攪勻，蒸干，置層析柱（內(nèi)徑1.5 cm）上，用甲醇洗脫至洗脫液無色，洗脫液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液；另取處方中分別缺龍膽、梔子的其他藥材按制備工藝分別制成陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；取龍膽苦苷、梔子苷對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述5種溶液各2～5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（20∶1∶0.5）為展開劑，展距13 cm，取出，晾干，再以上述展開劑展開3次，展距13 cm，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視；再噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。龍膽、梔子的TLC見圖3。

圖2 黃連的TLC1、5.鹽酸小檗堿對照品；2～4.供試品；6.缺黃連陰性對照溶液Fig 2 TLC of Coptidis Rhizoma1，5.berberine hydrochloride control；2～4.test samples；6.negative control without Coptidis Rhizoma

圖3 龍膽、梔子的TLCA.紫外光燈（254 nm）檢視；B.日光檢視；1.缺龍膽陰性對照；2.缺梔子陰性對照；3～5.供試品；6.龍膽苦苷對照品；7.梔子苷對照品Fig 3 TLC of Gentianae Radix Et Rhizoma and Gardenia jasminoidesA.under uvlight（254 nm）；B.under sunlight；1.negative control without Gentianae Radix Et Rhizoma；2.negative control without G.jasminoides；3～5.test samples；6.gentiopicrin control；7.jasminoidin control

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[16～18]

色譜柱：DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.45 mm×0.85μm）；檢測器溫度：300℃；進樣口溫度：240℃；柱溫：130℃；載氣：高純氮氣；載氣流速：3.0 mL·min-1；分流比：25∶1；進樣量：1.0μL。在此色譜條件下薄荷腦、冰片（以異龍腦、龍腦計）、水楊酸甲酯色譜峰均能有效分離，在薄荷腦、冰片色譜峰相同位置處無色譜峰出現(xiàn)。色譜見圖4。

圖4 氣相色譜圖A.供試品；B.內(nèi)標；C.陰性對照；D.混合對照品；1.薄荷腦；2.異龍腦；3.龍腦；4.水楊酸甲酯Fig 4 GC chromatogramsA.test sample；B.internal standard；C.negative control；D.mixture control；1.menthol；2.isoborneol；3.borneol；4.methyl salicylate

3.2 內(nèi)標溶液的制備

取水楊酸甲酯適量，加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標溶液。

3.3 混合對照品貯備液的制備

精密稱取冰片對照品28.57 mg，薄荷腦對照品28.47 mg，置25 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液。

3.4 供試品溶液的制備

取本品0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，取出，放冷，補足失重，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液稀釋成一系列濃度的對照品溶液，分別精密吸取1.0μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積。以對照品峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（X）為橫坐標，檢測濃度（Y）為縱坐標，分別制備冰片、薄荷腦的回歸方程。結(jié)果，冰片、薄荷腦的回歸方程分別為Y＝0.355 9X+0.010 7（r＝0.998 7，n＝7）、Y＝0.360 0X+0.008 4（r＝0.998 4，n＝7），表明冰片、薄荷腦的檢測濃度分別在56.9～683.3、56.0～672.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與對照品峰面積和內(nèi)標峰面積的比值呈良好線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液1.0μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定薄荷腦、冰片峰面積，計算其與內(nèi)標峰面積的比值。結(jié)果，RSD分別為2.1%、1.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液適量，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h測定薄荷腦、冰片峰面積，計算其與內(nèi)標峰面積的比值。結(jié)果，RSD分別為0.9%、0.9%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品適量，共6份，分別按“3.4”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定薄荷腦、冰片峰面積，按內(nèi)標法計算。結(jié)果，薄荷腦、冰片含量分別為6.70、7.25 mg/粒，RSD分別為1.10%，1.26%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量（冰片：5.10 mg/粒，薄荷腦：5.32 mg/粒）的樣品9份，分為3組（樣品中冰片的量為1.3、2.5、3.8 mg，薄荷腦的量為1.3、2.6、3.9 mg），每組分別精密加入含冰片（1.220 3 mg·mL-1）、薄荷腦（1.301 2 mg·mL-1）的混合對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果，冰片的平均回收率為98.68%，RSD＝1.1%（n＝9）；薄荷腦的平均回收率為99.07%，RSD＝1.0%（n＝9）。

3.10 樣品含量測定

按所建立的方法，對15個批次（依次為序號1到15）的樣品進行含量測定，結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（mg/粒，n＝5）Tab 1 Results of content determination of samples（mg/piece，n＝5）

4 討論

為有效提取制劑中的冰片、薄荷腦，筆者對回流和超聲這2種常用的方法進行了比較，溶劑采用易溶解冰片的無水乙醇。結(jié)果顯示，采用回流方法進行提取時，含量略高于超聲提取，但無顯著差異。為保證方法的耐用性，從節(jié)約能源、操作簡便的角度考慮，采用超聲30 min作為提取方法。

由于梔子苷、龍膽苦苷均為環(huán)烯醚萜類，性質(zhì)相似，故試驗中單獨做龍膽、梔子TLC鑒別時，發(fā)現(xiàn)陰性對照疑似有干擾成分，不能達到良好分離效果。而采用3次展開，同時檢測2種成分的方法分離效果良好。

因已知冰片、薄荷腦具揮發(fā)性，在常溫下不穩(wěn)定，在生產(chǎn)過程中易損失，因此含量測定選用冰片、薄荷腦為指標。冰片對照品中含龍腦、異龍腦2種成分，含量測定是以2種成分之和為指標。

樣品含量測定結(jié)果表明，不同廠家熊膽丸中薄荷腦、冰片的含量差值較大，薄荷腦含量最高與最低相差70倍，冰片的含量則相差26倍，這可能與工藝、原料質(zhì)量有關(guān)。筆者還發(fā)現(xiàn)，有的批次甚至未檢出相關(guān)成分，其膠囊內(nèi)容物亦無薄荷或冰片樣氣味。有效成分偏低，必將影響治療效果，應(yīng)當(dāng)引起重視。根據(jù)處方及測定結(jié)果，建議薄荷腦、龍腦含量均不低于4.0 mg/粒。

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